基于PI3K/Akt通路探究下调miR-206对肋骨骨折模型大鼠骨折愈合的影响

王 强，高书军*，赵鹏飞，刘 岩

(1.河北省张家口市第二医院麻醉科，河北 张家口 075000；2.河北省张家口市第二医院骨科，河北 张家口 075000)

肋骨骨折是最常见的钝性胸外伤后损伤，会增加肺部感染及死亡的风险，尤其是老年人预后更差[1-2]。MicroRNAs (miRNAs)通过靶向结合mRNA负向调控基因表达[3]，与胚胎发育、器官形态、肿瘤发生和细胞分化密切相关[4]。以往研究表明，miR-206 可以通过靶向PI3K/Akt通路发挥调控脂肪细胞新生、血管形成等生物学过程[5-6]，但其在骨折愈合中的作用尚不明确。另一方面，磷脂酰肌醇3-激酶The phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路在促进成骨细胞增殖、分化以及骨质沉积中发挥了重要作用[7-8]。因此本研究建立大鼠肋骨骨折模型，研究下调miR-206通过PI3K/Akt通路发挥骨折愈合的具体机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 10周龄SPF级雄性SD大鼠(200±20)g共32只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号为SCXK(京)2014-0001。大鼠饲养于屏蔽环境内，恒温22～24 ℃，恒湿(55±5)%，人工光照明暗各12 h。

1.2大鼠肋骨骨折的建模及分组 使用异氟烷麻醉(1%～2%)大鼠，将其置于右侧卧位，分层切开皮肤、分离皮下组织和肌肉,剥开骨膜, 暴露出第6肋骨，并横向切断, 使肋骨自由移动，然后分层对位缝合。手术后令大鼠恢复1 d后；随机将手术后的大鼠分为对照组(control)和miR-206组，每组各16只。miR-206组的大鼠在骨折断端注射miR-206抑制剂(miR-206 inhibitor，50 μg，30 μL，由上海吉凯基因医学科技股份有限公司提供)，对照组仅注射等量生理盐水，连续注射7 d，具体注射方法及剂量均参照已发表文献[9]。

1.3micro-CT检测 在手术后的14、28 d对大鼠的肋骨骨折部位进行扫描。使用vivaCT40 micro-CT扫描感兴趣区域(VOI，以骨折断端为中心包含周围骨痂)，X 射线管获取显微断层扫描切片(能量/强度为70 kVp/114 μA)，35 μm体素尺寸进行3D重建。3D高斯滤波器 (σ = 0.8, support = 1) 降噪。扫描结束后用Micro-CT自带的软件进行定量分析，使用二维建模分析每一层轴位片上骨痂总面积(total callus area，TA)及骨性骨痂面积(bone area，BA)，并通过三维分析获得所有层面骨痂总体积(total callus volume，TV)，骨性骨痂体积(bone volume，BV)，以及骨体积分数(BV/TV)。

1.4Western Blot 采用Western Blot法检测Akt及PI3K蛋白水平。使用Minute(TM) 骨组织总蛋白提取试剂盒(Invent，美国)，对骨总蛋白进行提取，测定蛋白浓度并加入4×SDS蛋白上样缓冲液(按1∶3的比例)煮沸后备用。每孔加入20 μg样品或6 μL Marker进行电泳，浓缩胶电压80 V，25 min，分离胶电压120 V，50 min，电泳后转膜，3%脱脂牛奶(体积分数0.5%TBST)封闭1 h。孵育一抗，分别用Akt兔单克隆抗体(1∶1 500)、PI3K兔单克隆抗体(1∶1 500)，β-actin兔单克隆抗体(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜。后以TBST洗3次。二抗用山羊抗兔IgG(1∶3 000)，室温下孵育30 min后，TBST洗3次，5 min/次。ECL曝光显影，Image J图像处理软件分析结果。

1.5qPCR检测Akt、PI3K及miR-206表达水平 采用Trizol法提取骨样本的总RNA，Nanodrop测定RNA浓度后按照反转录试剂盒说明合成cDNA。qPCR反应体系为20 μL；上游和下游引物各(10 μmol/L)，1.0 μL，cDNA 2.0 μL，SYBRTM Premix Dimer Eraser(2×)10 μL，ddH2O 4.0 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，35个循环。熔解曲线：95℃ 1 min，55 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，每个样品设3个技术重复，结果采用2-△△Ct法分析mRNA相对表达量，引物序列见表1。

表1 qPCR实验所用引物Table 1 Primers for qPCR assay

1.6统计学方法 应用SPSS 27.0统计软件处理数据。计量资料比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1大鼠术后的一般状态 miR-206组和对照组共32只大鼠均成活并造模成功。2组造模后的大鼠术后第1天均活动自如，进食、饮水正常。术后1周，大鼠伤口局部红肿逐渐消退，伤口未出现发炎情况。

2.2骨组织愈合情况比较 Micro-CT结果显示自14 d开始，2组均有骨痂开始形成，至28 d骨痂塑形改建，说明随着时间推移两组的骨折均有不同程度的愈合。2组CT 2D和3D重建的结果均显示，14 d和28 d时miR-206注射组骨痂量较对照组明显增加，骨干趋于正常，骨密度更高；而对照组在28天时仍未愈合(图1)。此外，Micro-CT结果显示各组大鼠的骨痂总体积、骨性骨痂体积、骨骼体积比均随时间逐渐增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，miR-206干预后，在不同时间点均明显促进了骨痂的形成和骨折的愈合，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

图1 不同时间点2组大鼠肋骨骨折部位CT扫描及重建图Figure 1 CT scans and reconstructions of the rib fractures of rats between two groups at different time points

表2 不同时间点两组大鼠骨痂愈合指标比较Table 2 Comparison of callus healing indexes of rats between two groups at different time points

2.32组大鼠骨组织miR-206、Akt及PI3K表达量不同时间点的比较 qPCR检测2组大鼠肋骨组织中miR-206、Akt及PI3K表达量，与对照组相比，miR-206抑制剂干预后，不同时间点的miR-206表达量均显著下调；而Akt及PI3K表达量与对照组比较均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 2组大鼠骨组织miR-206，Akt及PIK3表达量不同时间点的比较Table 3 Comparison of the expression levels of miR-206, Akt and PIK3 in the bone tissues between two groups at different time points

2.42组大鼠肋骨组织Akt及PI3K蛋白水平不同时间点的比较 免疫印迹法检测不同时间点大鼠骨组织中的Akt及PI3K蛋白水平如图2所示。与对照组比较，miR-206干预不同时间后，Akt及PI3K的蛋白含量均明显升高(P<0.05)，见图2，表4。

图2 不同时间点大鼠肋骨中Akt及PI3K的蛋白量变化Figure 2 Changes in the protein levels of p-Akt and p-PI3K in the ribs of rats at different time points

表4 不同时间点大鼠肋骨中Akt及PI3K的蛋白量变化Table 4 Changes in the protein levels of Akt and PI3K in bone tissues of rats at different time points

3 讨 论

肋骨骨折是胸部损伤中常见的并发症之一，其特点具有发病急、病情扩展迅速、致死率高等[10]。其对肺脏、心脏、血管、神经等造成的损伤往往会造成严重的后果，甚至会危及生命。因此，亟待开发出针对新靶点的治疗策略。已有大量文献报道了miRNAs 在调节骨折愈合过程中的成骨分化和成骨修复中起了重要的作用[11]。miRNA是长度为19～25个核苷酸的短链非编码RNA分子，首次在秀丽隐杆线虫中被发现，广泛分布于植物和动物体内，参与DNA翻译后的转录抑制过程[12]。其具体机制为，miRNA与信使RNA 3 ′UTR的结合区域称为种子区，miRNA与种子区的完全互补结合可导致靶标mRNA的降解，而不全的互补配对可导致翻译抑制[13]。miR-206最初被发现是一种参与肌肉分化过程的特异miRNA，然而，近年来亦有文献报道miR-206表达于成骨细胞，因此可能参与了成骨细胞中的生物学过程[14]。这也在其文献中得到验证。Xie等[14]研究发现，在成骨细胞过表达miR-206能够抑制其分化成熟，相反，沉默miR-206能够促进成骨细胞的分化，其具体机制为间隙连接蛋白connexin-43(Cx43)为miR-206的靶基因，而Cx43主要分布于神经肌肉接头处，在胚胎期调控了肌肉骨骼的发育，因此当其受到miR-206的负向调控时可以抑制骨骼发育；在体研究表明，miR-206转基因小鼠表现出骨量降低、骨皮质变薄[15]。以上这些研究表明了miR-206与骨细胞的分化和骨质沉积关系密切。但其在骨折愈合中的作用尚不明确，miR-206可能在骨折中发挥了负向调节的作用。本研究应用大鼠肋骨骨折模型，探讨miR-206在骨折中表达的动态变化和其生物学功能，结果表明随着骨折的愈合，miR-206的表达量逐渐降低；且通过注射miR-206抑制剂降低其表达，可以显著促进肋骨骨痂的形成和骨折的愈合过程，明确了miR-206在大鼠肋骨骨折的愈合过程中，能够抑制骨痂形成和骨质沉积，从而发挥抑制作用。

PI3K/Akt信号通路是生物体内最重要的信号通路之一，在调控葡萄糖代谢、细胞凋亡、细胞增殖、转录和细胞迁移等多种生物学过程中，发挥了至关重要的作用[16]。PI3K可以磷酸化磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸(phosphatidylinositol(4,5)-bisphosphate，PIP2]为磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸[phosphatidylinositol(3,4,5)-triphosphate，PIP3]，PIP3 作为第二信使可以激活 AKt 并一步调控下游的细胞生物学过程[17]。在骨骼系统中，越来越多的证据表明PI3K/Akt通路作为成骨细胞和破骨细胞分化成熟的关键调节因子，可以通过促进两类细胞的存活和分化，从而调节骨代谢水平并维持骨量的平衡[18-19]。例如，Sanchez-Gurmaches 等[20]研究发现Akt1/Akt2 双基因敲除小鼠可表现出骨化延迟及骨骼的畸形，Zhao等[21]研究发现Akt1敲除小鼠的股骨长度较野生型短，且次级骨化中心形成延迟。此外，Li等[22]发现在骨折愈合过程中，Akt可以促进骨痂的形成，增强股骨的机械性能从而发挥促进骨骼愈合的作用。以上研究结果说明Akt的激活可能能够通过调节成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡，从而发挥促进骨折的愈合的作用。本研究的结果显示，随着骨折愈合过程的进展，PI3K和Akt的蛋白含量逐渐升高，表明了PI3K/Akt通路的激活，并参与了骨痂形成和骨矿物质沉积，与以往的文献报道一致。另一方面，以往的研究亦表明，miR-206 可以通过靶向c-Met 蛋白，从而调控其下游PI3K/Akt通路的活性，继而发挥调控脂肪细胞新生、肿瘤细胞增殖、血管形成等生物学过程。因而推测miR-206在骨折愈合中，可能通过与PI3K/Akt信号通路发生交互作用，从而影响骨痂形成和骨质沉积最终干预骨折的愈合。本研究的结果显示，通过向肋骨骨折断端注射miR-206抑制剂，不仅可以显著降低肋骨组织中miR-206的表达水平，并且能够进一步升高PI3K、Akt的mRNA和蛋白水平，这表明下调miR-206能够使PI3K/Akt信号通路将进一步活化，从而发挥加速肋骨骨折愈合的分子生物学功能。

综上所述，本研究表明在大鼠肋骨骨折模型中，下调miR-206能够促进大鼠肋骨骨折的恢复，其作用机制与PI3K/Akt通路有关。但骨折愈合过程机制复杂，参与的信号通路众多。因此miR-206促进肋骨骨折愈合机制仍需要进一步的探索。