云南保山初烤烟致香成分与生态因子的相关性研究

高晋军，李 敏，关罗浩，王初亮，战 磊，黄宙凯，高卫锴，黄 磊

（广东中烟工业有限责任公司 原料供应中心，广东 广州 510310）

0 引言

烟草香味是评定烟草及其制品品质的重要因素之一，烟叶中致香成分的种类和含量直接影响着烟叶及制品的香气品质［1］。初烤烟叶中致香成分的解析为烟草后续加工奠定了基础，烟叶中致香成分和含量受品种、部位、生态区域、栽培措施、烘烤调制技术等多种因素的影响［2］，遗传因素影响香气物质的性质和种类，环境因素则主要影响香气物质的含量和组成比例［3-7］。目前，学者们针对烟叶致香成分的影响因素进行了研究，李伟等［8］研究了不同香型烟叶致香物质组成比例及其差异，结果表明，棕色化反应降解产物、新植二烯、苯丙氨酸类降解产物、类西柏烷类降解产物的组成比例在不同香型烟叶间具有显著的差异。丁燕芳等［9］采用方差分析了河南、云南、贵州3个不同的生态类型区种植的4种烤烟，结果表明，环境因素是影响美拉德反应产物、苯丙氨酸类降解产物含量的关键因素，对类胡萝卜素降解产物和新植二烯的影响主要通过与生态因素互作起作用。Yang等［10］利用云南、贵州、河南3个地区烟叶致香物质含量的差异，采用PCA分析开展了烟叶产地的溯源，结果表明，不同的生态因子（平均温度、降雨量、光照时间、海拔高度）条件下烟叶的致香成分存在差异。Zhang等［11］采用方差分析和支持向量机算法测算了影响致香成分含量的生态因素依次为：光照时间、产地最高温度、降雨量、产地的最低温度、产地的平均温度、空气湿度。Yun等［12］采用相关性分析研究了光照强度对中性致香成分的影响，结果表明，光照强度对中性成分的影响显著。 Liu等［13］基于烟草中56种致香成分数据并利用PCA和SIMCA模型对四川省4个地区的烟叶进行了产地溯源，结果表明，在此4个地区烟叶品种对致香成分的影响小于生态环境的。关于致香成分整体数据信息与多种生态因子的相关性分析鲜有报道。

保山位于云南西部边陲，地处低纬高原，属北回归线附近、“三江并流”大区域和横断山脉生物多样性区域，立体气候明显，是中国烟叶生产优势区［14］。周越等［15］研究了保山高海拔地区不同烤烟品种适宜性，结果表明，海拔对不同品种烟叶的化学成分的影响较大。何晓健等［16］研究了保山龙川江流域冬春烟和夏烟主要化学成分特点，结果表明，春夏气候的差异对烟叶主要化学成分存在一定的影响。目前，对保山地区烟叶致香成分进行分析的文献研究较少［17-18］，为此，本研究以云南省保山地区5个区县2020年种植的107个初烤烟叶样品（品种涵盖该地区主要种植的红大、K326、云87）为研究对象，探索不同生态环境因子（平均温度、降雨量、光照时间、海拔高度）在保山地区的分类，并指导烟叶致香成分含量的PLS-DA分析，从中筛选出保山地区受环境因子影响较大的致香成分，为保山地区烟叶的种植规划提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

从保山地区的1区4县（隆阳、昌宁、腾冲、龙陵、施甸）采集2020年初烤烟叶样品102份（其中隆阳21个、昌宁14个、腾冲20个、龙陵23个、施甸24个，部位：C3F），烟叶品种为云烟87、红大和K326。

1.2 方法

1.2.1 采样方法 选取农户于采收期初烤的代表性烟叶样品2.0 kg，并编号，再记录采样地点的经纬度和海拔高度，作为1个样品。从样品中取200.0 g烟叶粉碎，充分混匀样品后取100.0 g烟末（过60目筛）封装，作为分析样本备用。

1.2.2 样品预处理方法 准确称取备用样品25.0 g，每个样本平行3份，置于恒温恒湿箱（温度22℃，湿度60%）平衡24 h，采用同时蒸馏萃取法，萃取剂为二氯甲烷。将盛有烟末的一端加入350 mL蒸馏水置于电热套上加热，另一端加入30 mL二氯甲烷置于水浴锅中加热，水浴锅温度为60 ℃，同时蒸馏萃取2 h。萃取完成后，采用旋转蒸发仪（压力为560 MPa，转速为65 r/min）将萃取液浓缩至1.0 mL，装入样品瓶中，待测。

1.2.3 致香成分含量测定 致香成分含量的测定采用GC/MS法，使用气质联用分析仪（Agilent GC 6890N/MS5975I）对上述萃取浓缩液进行分析，以萘为内标物，所得图谱经计算机谱库（NIST05，Wiley275）检索，按照文献［19］的方法计算各峰的相对含量。检测指标：醇类10项、醛类14项、酮类22项、酸类3项、酯类7项、酚类6项、杂环类7项、新植二烯等，共71项指标。

1.2.4 数据分析 气象数据由保山市气象局提供，海拔数据由烟叶采用GPS记录仪记录。气象及海拔数据系统聚类分析、不同地区初烤烟叶致香成分的多重比较分析均采用SPSS 14.0（美国，IBM）软件完成。气象及海拔数据、初烟致香成分含量的正交偏最小二乘判别（OPLS-DA）分析均由SIMCA-P+14.5软件（瑞典，UMETRICS）完成。

2 结果与讨论

2.1 保山地区气象、海拔聚类及其OPLS-DA分析

2020年4～9月间昌宁、隆阳、腾冲、龙陵、施甸5个区县的平均温度、降雨量、日照时数及各区县取样点的平均海拔高度如图1～图4所示。

由图1可知，平均光照时间最长的区县为昌宁，最短的区县为腾冲；由图2可知，降雨量最多的地区为龙陵，隆阳和施甸的降雨较少；由图3可知，日照时数最长的区县为龙陵，腾冲县的最低；由图4可知，取样点平均海拔最高的区县为施甸，所有区县的取样点的平均海拔均超过1600 m。

图1 2020年4～9月5个区县的平均气温

图2 2020年4～9月5个区县的降雨量

图3 2020年4～9月5个区县的日照时数

图4 4～9月5个区县取样点的平均海拔

为了考察上述各因素在5个地区的差异性，2020年对5个区县大田种植期（4～9月）的烟草增加了取样点，即对降雨量、光照时间及平均温度的统计分析细分为按每月的上旬、中旬及下旬进行。为考察平均温度、降雨量、光照时间、海拔高度（该地区所有取样点的平均海拔高度）在昌宁、隆阳、腾冲、龙陵、施甸5个区县间差异性的大小，对采集得到的数据进行了系统聚类分析。由图5可知：当5作为聚类阈值时，5个地区的气象及海拔数据被聚成3类，聚类结果为：隆阳、施甸和昌宁聚为1类；腾冲为1类；龙陵为1类。

图5 5个区县采集数据的系统聚类分析

为进一步明晰5个区县的气象及海拔数据被聚成3类的影响因素，对上述地区的气象因素及海拔数据赋值进行对应的分类标签：隆阳、施甸和昌宁赋分类标签为1，腾冲分类标签为2，龙陵分类标签为3，再进行气象和海拔数据的OPLS-DA分析，结果如图6所示。由图6可知，OPLS-DA对上述5个区县气象和海拔数据分类效果与上述聚类分析结果相似，通过OPLS-DA各因子载荷值与地区点的距离可知，第1类（施甸、隆阳、昌宁）与另外2类的主要差异指标为海拔，4、8和9月的日照时数，以及4、6、7、8和9月的平均气温；第2类（腾冲）与其他2类的主要差异指标为5月和6月的日照时数；第3类（龙陵）与另外2类的主要差异指标为4～9月的降雨量和7月的日照时数。

图6 基于OPLS-DA分析的各气象因素与系统聚类的相关性

2.2 致香成分含量差异性分析

对保山不同产区烤烟中71种致香成分含量进行了多重比较分析，结果表明，5个产区间致香成分无明显差异的化学成分有：吡啶、5-甲基糠醛、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚，其余指标在不同产区间具有显著性差异。在所有检测的71项指标中，特征性致香成分新植二烯含量从高到低的区县依次为腾冲、龙陵、昌宁、隆阳、施甸，其中施甸地区的含量显著低于其他4个地区。昌宁地区1H-吡咯-2-甲醛、1-（1H-吡咯-2-基）-乙酮含量高于其他地区；龙陵地区3-甲基-2-丁烯醛、糠酸、苯乙醛、苯乙醇、胡薄荷酮、2,3-二氢苯并呋喃、吲哚、茄酮、β-大马酮、β-二氢大马酮、β-紫罗兰酮、丁基化羟基甲苯、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮 B、巨豆三烯酮 C、巨豆三烯酮 D、肉豆蔻酸甲酯、棕榈酸甲酯含量高于其他地区；施甸地区的3-甲基-1-丁醇含量低于其他地区，己醛、2,4-庚二烯醛A、2,4-庚二烯醛B、壬醛、藏花醛、香叶基丙酮、3-氧代-α-紫罗兰醇、寸拜醇、亚麻酸甲酯、金合欢基丙酮B含量高于其他地区；隆阳和腾冲地区的致香成分没有显著高于其他地区的。研究结果表明，不同产区间致香成分存在着一定的差异，这为分析气象因子及海拔对致香物质化学成分的影响提供了基础条件。

2.3 致香成分含量的OPLS-DA分析及主要影响致香成分指标的筛选

通过对保山5个县市气象及海拔聚类分析结果分析可知，昌宁、隆阳、腾冲、龙陵、施甸被分成了3类。为探寻气象及海拔条件对致香成分的影响，以生态环境及海拔高度的聚类分析的分类结果作为OPLS-DA模式识别的监督条件，即分别将隆阳施甸和昌宁为第1类；腾冲为第2类，龙陵为第3类。对3类对应区县样品的致香成分进行OPLS-DA分析，第1、第2主成分得分分布结果如图7。由图7可知， 3类地区致香成分的OPLS-DA分类效果较明显，说明上述3类地区的烟叶在致香成分含量信息中存在差异。

图7 5个地区样品致香成分OPLS-DA分类模型分类效果图

为进一步考察致香成分指标对分类的贡献率，采用OPLS-DA结合变量投影重要性VIP（Variable Importance in the Projection）进行分析［20］，计算公式如下：

式中：VIPj表示第j个自变量xj的投影重要性指标；P表示自变量的个数；m为提取的有效成分个 数；Whj为 轴Wh的 第j个 分量表示成分th对因变量Y的解释能力，r(y;th)是因变量Y和主成分th的相关系数表示m个成分t1，t2,…，tm对Y的累计解释能力。VIP值反映的是所有自变量X（致香成分指标）对于因变量Y（分类）的解释能力，VIP值越大，对Y的解释能力越强，VIP值大于1的变量具有较大的相关性，对于Y的解释具有重要贡献。

由表1可知，VIP值大于1的指标共有24个，依次为：糠酸、β-大马酮、茄酮、巨豆三烯酮D、丁基化羟基甲苯、苯乙醇、β-二氢大马酮、巨豆三烯酮B、3-甲基-2-丁烯醛、2-吡啶甲醛、巨豆三烯酮C、β-紫罗兰酮、1-(3-吡啶基)-乙酮、巨豆三烯酮A、4-甲基苯酚、苯甲醛、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、吲哚、2,3-二氢苯并呋喃、二氢猕猴桃内酯、3-氧代-α-紫罗兰醇、苯乙醛、壬醛、香叶基丙酮。

表1 偏最小二乘判别分析变量投影重要性因子提取

通过OPLS-DA分析，从71种致香成分中筛选出来24个指标，包括：（1）3个β-胡萝卜素降解产物：β-紫罗兰酮、β-二氢大马酮、二氢猕猴桃内酯。（2）6个叶黄素降解产物：β-大马酮、3-氧代-α-紫罗兰醇、4个巨豆三烯酮异构体（巨豆三烯酮 A、B、C、D）。（3）1个挥发性醇类：苯乙醇。（4）5个挥发性醛类：3-甲基-2-丁烯醛、2-吡啶甲醛、壬醛、苯甲醛、苯乙醛。（5）1个挥发性酮类：1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮。（6）2个半挥发性酮类：茄酮、香叶基丙酮。（7）2个杂环：吲哚、2,3-二氢苯并呋喃。（8）其他类化合物：糠酸、丁基化羟基甲苯、1-(3-吡啶基)-乙酮、4-甲基苯酚。

由施甸、隆阳、昌宁、腾冲和龙陵地区叶黄素降解产物总量、β-胡萝卜素降解产物总量、巨豆三烯酮类化合物总量、糠酸含量的对比分析（表2）可知，叶黄素降解产物、β-胡萝卜素降解产物、巨豆三烯酮类化合物总量和糠酸的含量随着降雨量和光照时间的增加而增加。由于5个地区的平均温度和本次取样的平均海拔高度存在的差异较小，因此，在进一步的探索分析中需扩大采样量，对检测指标进行分析，并通过连续多年跟踪研究，从机理层面分析品种、部位、等级及栽培措施等对烤烟中致香含量的影响，筛选并建立更为稳健的、受环境因子影响较大的致香成分指标。

表2 5个区县烤烟中叶黄素降解产物、β-胡萝卜素降解产物、巨豆三烯酮类化合物、糠酸含量的分析 μg/g

3 结论

致香成分对烟草品质具有重要的影响，为探索不同生态因子条件下种植的烤烟致香成分物质的变化，本文采用生态因子（平均温度、降雨量、日照时长、海拔高度）的系统聚类分析结果指导致香成分的PLS-DA分析，并从中筛选出保山5个区县受环境因子影响较大的24种致香成分。进一步分析了叶黄素降解产物、β-胡萝卜素降解产物、巨豆三烯酮类化合物总量和糠酸的含量与降雨量和光照时间的正相关关系。