扁塑藤素对LPS诱导的HUVEC细胞功能损伤和焦亡的作用

吴明月， 黄紫霞， 许 锋， 龚 俊， 熊 韬， 王睎之， 王德明

(1.南华大学衡阳医学院附属第二医院麻醉科，湖南省衡阳市421001；2.南华大学船山学院，湖南省衡阳市421001)

内皮细胞的功能障碍和形态学损伤可导致白细胞黏附、血小板活化、氧化应激和炎症，进而促进动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)的形成[1-2]。预防血管内皮细胞损伤对于防治As性疾病具有重大意义。扁塑藤素(pristimerin，Pri)是一种天然三萜系化合物，扁塑藤素及其相关化合物表现出抗炎、抗氧化和抗疟疾的活性，以及对不同类型癌症的抗肿瘤作用[3-5]。本实验拟建立脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)损伤模型，探究扁塑藤素对LPS诱导内皮细胞损伤的保护作用机制，从而为扁塑藤素的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

HUVEC(中国科学院上海细胞库)；LPS(Sigma-Aldrich 公司，美国)；扁塑藤素(Santa cruz公司，美国)； CCK-8试剂盒(GLPBIO公司，美国)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；人白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β) 、IL-18酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)试剂盒(R&D Systems,美国)；GAPDH抗体(Proteintech公司，美国)；Anti-pro Caspase-1+p10+p12抗体(Abcam,ab179515)；GSDMD抗体(Santa cruz,sc-393656)；NLRP3抗体(Novusbio,NBP2-12446SS);RNA快速提取试剂盒(奕杉生物科技有限公司)；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒(Takara,日本)。

1.2 HUVEC培养及分组

HUVEC用含10%FBS、1%青链霉素双抗DMEM高糖完全培养基,在37 ℃、5%CO2、95%空气的饱和湿度培养箱中培养。HUVEC细胞分为对照组、LPS组(10 mg/L)、低、中、高剂量(0.1、0.2、0.4 μmol/L)扁塑藤素组。根据分组分别加入培养基、含终质量浓度为10 mg/L LPS的培养基或含LPS+低、中、高剂量扁塑藤素的培养基。各给药组的扁塑藤素均在LPS刺激前2 h加入，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h,用于后续检测分析。

1.3 CCK-8法检测HUVEC细胞活力

在96孔板中加入100 μL HUVEC细胞悬液(6×102个/L)，培养箱中孵育12 h，预实验确定LPS质量浓度。给药 24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂后继续培养2 h。酶标仪450 nm处测定各组光密度，计算细胞增殖活力。HUVEC增殖活力(%)=(OD给药-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100%。

1.4 乳酸脱氢酶释放实验

收集细胞培养上清液，使用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒，按照说明书测定乳酸脱氢酶水平。酶标仪490 nm处测定各组样品光密度。

1.5 ELISA检测IL-18、IL-1β蛋白

收集细胞培养上清液，使用ELISA试剂盒，按照说明书检测IL-18、IL-1β含量。

1.6 MDA和SOD水平的测定

收集细胞培养上清液，使用MDA和SOD检测试剂盒，按照说明书检测MDA和SOD含量。

1.7 Western blotting法检测焦亡相关分子蛋白

提取总蛋白，加入RIPA裂解液裂解细胞，采用BCA法进行蛋白含量测定，提取的蛋白变性上样后进行电泳，电泳后电转移至 PVDF膜，5%脱脂牛奶室温下作用2 h，4 ℃孵育一抗过夜，洗膜30 min后室温孵育二抗1 h，再次洗膜30 min，ECL化学发光法得到条带，并计算蛋白相对表达水平。

1.8 qPCR检测焦亡相关分子mRNA

用RNA快速提取试剂盒提取细胞总RNA，Nano Drop2000分光光度计测定RNA水平，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq II 试剂盒进行定量PCR检测。通过2-ΔΔct对结果进行分析，使用GAPDH作为内参基因，各基因引物序列及扩增片段长度见表1，计算目的基因的相对表达量。

表1 引物序列和扩增片段长度

1.9 统计学方法

2 结 果

2.1 扁塑藤素对细胞活力的影响

随着LPS质量浓度增加，HUVEC细胞活力逐渐下降， 20 mg/L LPS处理24 h时细胞死亡数较多，因此选择了细胞活力50%时的10 mg/L LPS。使用低、中、高剂量扁塑藤素对细胞进行预处理后，扁塑藤素可以改善 LPS对HUVEC的损伤，并呈剂量依赖性，0.4 μmol/L时效果最佳(P<0.05；图1)。

图1 扁塑藤素对LPS诱导的HUVEC细胞活力的影响(n=3)

2.2 扁塑藤素对LDH含量的影响

与对照组比较，LPS组LDH含量显著升高(P<0.05)；扁塑藤素组LDH含量均显著降低，高剂量扁塑藤素组降低最显著(P<0.05；图2)。

图2 扁塑藤素对LPS诱导的HUVEC细胞上清液中LDH含量的影响(n=3)

2.3 扁塑藤素对MDA、SOD含量的影响

与对照组比较，LPS组MDA显著增加，SOD显著降低(P<0.05)。与LPS组比较，中、高剂量扁塑藤素组MDA降低，SOD升高 (P<0.05；图3)，提示扁塑藤素以剂量依赖的方式逆转LPS作用。

图3 扁塑藤素对LPS诱导的HUVEC细胞上清液中MDA、SOD含量的影响(n=3)

2.4 扁塑藤素对细胞焦亡的影响

与对照组比较，LPS显著提高HUVEC细胞上清液中IL-18和IL-1β蛋白水平，且该效应能被扁塑藤素组以剂量依赖的方式逆转(P<0.05;图4A和B)。与对照组比较，LPS显著提高 HUVEC 中焦亡相关分子NLRP3、GSDMD和Caspase-1的蛋白和mRNA表达水平，且该效应能被扁塑藤素组以剂量依赖的方式逆转(P<0.05;图4C、D和E)。

图4 扁塑藤素对LPS诱导HUVEC细胞焦亡的影响(n=3)

3 讨 论

血管内皮细胞在组织内环境稳定、维持体液平衡、炎症细胞浸润等方面起着重要作用，动脉粥样硬化的形成与血管炎症密切相关，而内皮功能障碍是动脉粥样硬化形成的第一阶段。LPS诱导炎症反应的主要原因是其对内皮细胞的毒性作用[6]。本研究探索了扁塑藤素在炎症诱导的HUVEC细胞毒性中的作用，发现LPS处理抑制了HUVEC的增殖，同时增加了LDH的释放，这表明LPS可诱导细胞功能损伤，而扁塑藤素预处理可呈剂量依赖性抑制LPS诱导的细胞功能损伤。

氧化应激是由氧化和抗氧化系统之间的不平衡引起的。LPS诱导的氧化应激是血管内皮细胞损伤的主要始发者。LPS诱导的内皮功能障碍与ROS的产生有关[7]。MDA是活性氧(reactive oxygen species，ROS)攻击细胞膜多不饱和脂肪酸形成的，是氧化应激的一个常用的生物标志物。SOD作为细胞抗氧化酶，是抵抗ROS毒性作用的第一道防线，在抗氧化防御系统中起着关键作用。研究表明，扁塑藤素通过核因子E2相关因子和MAPK/核因子-κB通路发挥抗氧化应激和抗炎作用[8]。为了了解扁塑藤素在LPS诱导的氧化应激中的影响，本研究测定了MDA及SOD含量，结果显示， LPS处理后HUVEC中MDA增加，SOD降低；然而，中、高剂量的扁塑藤素均可抑制上述反应。以上提示，抑制LPS诱导的氧化应激是扁塑藤素对内皮功能障碍起保护作用的机制。

Cheng等[9]研究表明，脂多糖引起的细胞内损伤会引发内皮细胞焦亡和血管完整性的丧失。同时文献[10-11]报道，内皮细胞死亡是动脉粥样硬化形成过程中的一个关键的初始阶段，而焦亡是动脉粥样硬化相关的内皮细胞死亡的主要类型。焦亡是一种新发现的促炎性、程序性细胞死亡类型，与包括动脉粥样硬化在内的几种心血管疾病有关[12-13]。焦亡的特征是Gasdermin家族介导膜孔的形成、细胞肿胀和质膜破裂，以及促炎性细胞内容物的释放，包括白细胞介素-1β、白细胞介素-18和高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein 1，HMGB1)[14]。GSDMD被激活的Caspase-1裂解，通过形成膜孔引发细胞焦亡[15]。研究表明，扁塑藤素通过直接阻断NEK7-NLRP3的相互作用来干扰NLRP3炎症体以及Caspase-1的激活和IL-1β的释放[16]，这可能有助于解释其抑制细胞焦亡作用。本研究假设扁塑藤素可能通过调节内皮细胞的焦亡在炎症中发挥作用，并进行了这项研究来证明这一点。

本研究表明，LPS介导内皮细胞焦亡，引起焦亡相关指标NLRP3、GSDMD、Caspase-1的蛋白及mRNA表达量升高，增加了细胞上清液中IL-1β、IL-18的蛋白含量，提示发生了细胞焦亡，而扁塑藤素能以剂量依赖的方式逆转上述反应，缓解了LPS诱导的内皮细胞焦亡，并调节焦亡相关蛋白，以抑制LPS引起的内皮细胞损伤。

综上所述，扁塑藤素对LPS诱导的内皮细胞损伤呈剂量依赖性保护，可能是通过抑制细胞焦亡和减轻氧化应激从而改善内皮细胞功能实现的。