QuEChERS结合UHPLC-MS/MS法测定半夏露颗粒中4种麻黄碱类成分

晏亮 丁银平 陈伟康 刘德鸿 李晶

关键词半夏露颗粒;麻黄碱类成分;QuEChERS方法;超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法;含量测定

半夏露颗粒是由生半夏、枇杷叶、远志（泡）、款冬花、桔梗、麻黄、甘草、陈皮和薄荷油9 味中药制成的复方制剂，具有止咳化痰的功效，用于咳嗽多痰、支气管炎的临床治疗[1]。半夏露颗粒现行质量标准除性状和颗粒剂通用制剂要求外，仅有针对薄荷脑的薄层色谱鉴别方法[1]。麻黄为方中臣药，具宣肺平喘作用，主要含有麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱、去甲伪麻黄碱等麻黄碱类成分，以上4 种成分均为半夏露颗粒的有效成分[2-3]。麻黄碱类成分肾上腺素受体活性很强，尤其是去甲伪麻黄碱对肾上腺素受体的半数效应浓度（median effectiveconcentration，EC50）为0.015 μmol/L[4]，浓度过高可引发血压升高、震颤、焦虑、失眠、头痛、心悸等严重不良反应[5-6]。因此，建立以麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱、去甲伪麻黄碱为代表的麻黄碱类成分含量测定方法对半夏露颗粒的疗效与安全性研究至关重要。笔者通过检索发现，现有文献大多仅测定了麻黄或其复方制剂中2～3 个麻黄碱类成分[7-11]，不能全面地评价含麻黄类药物的疗效与安全性。目前测定方法大多为高效液相色谱法[7-11]，但加大取样量、液液萃取前处理结合高效液相色谱法检测，难以达到预期的检测效果。

QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）是一种分散固体萃取技术，具有提取效率高、净化效果好的优点[12]。该方法被广泛应用于食品农药残留和功效成分检测前处理领域[12-17]。基于此，本研究首次以QuEChERS方法对样品进行前处理，结合超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱（ultra high performance liquidchromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）法同时测定半夏露颗粒中麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱、去甲伪麻黄碱4 种麻黄碱类成分的含量，旨在为该制剂的质量标准提升和质量安全控制提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有1290 型快速液相色谱仪（美国Agilent 公司），API 4000 型液相质谱联用仪（美国Applied Biosystems 公司），VORTEX WX型涡旋混合器（意大利VELP 公司），ST16R 型离心机、MicroPure UV/UF 型超纯水系统（美国Thermo Fisher Scientific 公司），KQ500E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），XS205DU型电子天平、ML204 型电子天平（瑞士MettlerToledo公司）等。

1.2 主要药品与试剂

半夏露颗粒共3 批，其中样品1（批号191003088）购自同药集团大同制药有限公司，样品2（批号21032701）购自云南裕丰药业有限公司，样品3（批号190314）购自广西双蚁药业有限公司。生半夏饮片（批号ST210201）购自贵州缔谊健康制药有限公司;远志饮片（批号2001027）、陈皮饮片（批号2001026）均购自安徽盛海堂中药饮片有限公司;桔梗饮片（批号200218）购自江西江中中药饮片有限公司;甘草饮片（批号170901）购自江西博源堂药业有限公司;款冬花饮片（批号190202171）、枇杷叶饮片（批号180804791）均购自康美药业股份有限公司;薄荷药材（批号20170915）产自江苏省泗洪县;以上饮片/药材均经江西省药品检验检测研究院丁银平主管中药师检验为真品。薄荷油為上述薄荷药材经挥发油提取法提取制得。

盐酸麻黄碱对照品（批号171241-201508，纯度99.8%）、盐酸伪麻黄碱对照品（批号171237-201208，纯度99.9%）均购自中国食品药品检定研究院;盐酸去甲伪麻黄碱对照品溶液（批号CX171206-20，质量浓度100μg/mL，供含量测定用）、盐酸甲基麻黄碱对照品溶液（批号CL180312-04，质量浓度1 000 μg/mL，供含量测定用）均购自美国Stanford Chemicals 公司;乙酸铵、甲酸、乙腈、甲醇均购自德国Sigma 公司，均为色谱纯;氯化钠（NaCl，分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司;十八烷基键合硅胶吸附剂（octadecyl bonded silica gel adsorbent，以下简称“C18”;粒径50 μm）、N-丙基乙二胺吸附剂（N-propyl ethylenediamine adsorbent，PSA;粒径40～63μm）均购自日本Shimadzu 公司;其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品储备液精密称取盐酸麻黄碱对照品10.54 mg、盐酸伪麻黄碱对照品10.80 mg，分别置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品储备液;精密吸取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品储备液各10 mL，盐酸去甲伪麻黄碱对照品溶液1.0 mL、盐酸甲基麻黄碱对照品溶液0.3 mL置于同一25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成含麻黄碱34.470 μg/mL、伪麻黄碱35.355 μg/mL、去甲伪麻黄碱3.223 μg/mL、甲基麻黄碱9.972 μg/mL（上述含量均由盐酸盐折算成麻黄碱类成分计）的混合对照品储备液，于-20 ℃密封贮存，备用。

2.1.2 供试品溶液取本品适量，研细，取粉末约0.2 g，精密称定，置于50 mL离心管中，加入含1%甲酸的甲醇10 mL，涡旋30 s，超声（功率250 W，频率25 kHz）提取20 min，加入无水硫酸钠4 g，涡旋30 s后，以10 000 r/min离心5 min，精密吸取上清液2 mL置于10 mL量瓶中，加含1%甲酸的甲醇至刻度，摇匀，制得待净化液。将上述待净化液1 mL转移至2 mL QuEChERS 净化管（含PSA100 mg、C18 50 mg）中，涡旋30 s，以10 000 r/min 离心1min，取上清液过0.22 μm有机相微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.1.3 缺麻黄阴性样品溶液按半夏露颗粒处方信息[1]，按工艺制法制成缺麻黄阴性样品。取缺麻黄阴性样品适量，研细，取粉末约0.2 g，精密称定，其余同“2.1.2”項下方法操作，制得缺麻黄阴性样品溶液。

2.2 色谱条件与质谱条件

2.2.1 色谱条件 以Agilent XDB-C1（8 4.6 mm×50 mm，1.8 μm）为色谱柱，以5 mmol/L 乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）为流动相A、乙腈为流动相B 进行梯度洗脱（0～13min，4%B;13～14 min，4%B→90%B;14～16 min，90%B;16～17 min，90%B→4%B;17～22 min，4%B）;流速为0.40 mL/min;柱温为30 ℃;进样量为2 μL。

2.2.2 质谱条件采用电喷雾离子化源，以多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式进行正离子扫描;气帘气压力为20.0 psi;离子源气体1 压力为60.0psi;离子源气体2 压力为55.0 psi;碰撞气压力为6 psi;喷雾电压为5 500 V;离子源气体温度为450.0 ℃。具体离子对检测条件见表1。

2.3 专属性试验

精密吸取“2.1.1”项下混合对照品储备液1 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇定容，摇匀，制得混合对照使用液。精密吸取该混合对照使用液1 mL，置10 mL 量瓶中，加含1%甲酸的甲醇定容，制得混合对照品溶液。取上述混合对照品溶液（含麻黄碱137.88 ng/mL、伪麻黄碱141.42 ng/mL、去甲伪麻黄碱12.89 ng/mL、甲基麻黄碱39.89 ng/mL）、供试品溶液和缺麻黄阴性样品溶液，按“2.2”项下条件进样测定，记录典型MRM 色谱图（图1）。结果显示，4 种麻黄碱类成分色谱峰峰形良好，同分异构体麻黄碱与伪麻黄碱能有效分离，阴性样品无干扰，表明该方法具有良好的专属性。

2.4 线性关系、检查限和定量限考察

精密吸取“2.3”项下混合对照使用液，用含1%甲酸的甲醇稀释，制成含麻黄碱1.38、2.76、6.89、13.79、27.58、68.94、137.88、165.46、206.82 ng/mL，伪麻黄碱1.41、2.83、7.07、14.14、28.28、70.71、141.42、169.70、212.13 ng/mL，去甲伪麻黄碱1.29、2.58、6.45、12.89、15.47、19.34 ng/mL，甲基麻黄碱1.99、3.99、7.98、19.95、39.89、47.87、59.83 ng/mL的系列工作溶液。取上述系列工作溶液，按“2.2”项下条件进样测定，以各待测成分峰面积为纵坐标（y）、质量浓度为横坐标（x）进行线性回归;以信噪比3 ∶1 确定检测限，以信噪比10 ∶1 确定定量限。结果显示，麻黄碱等4种成分在各自检测质量浓度范围内与峰面积的线性关系均良好（r>0.99），详见表2。

2.5 精密度考察

取“2.3”项下混合对照品溶液，按“2.2”项下条件连续进样6 次，记录峰面积。结果显示，麻黄碱、伪麻黄碱、去甲伪麻黄碱、甲基麻黄碱峰面积的RSD分别为0.4%、0.3%、0.5%、0.4%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性考察

取半夏露颗粒样品（批号191003088），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别在25 ℃下放置0、2、4、8、12、24、48 h 时按“2.2”项下条件进样测定，记录峰面积。结果显示，麻黄碱、伪麻黄碱、去甲伪麻黄碱、甲基麻黄碱峰面积的RSD 分别为0.9%、0.8%、1.4%、1.1%（n=7），表明供试品溶液在25 ℃下放置48 h 内稳定。

2.7 重复性考察

取半夏露颗粒样品（批号191003088），按“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液，共6 份，按“2.2”项下条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算各成分含量。结果显示，麻黄碱、伪麻黄碱、去甲伪麻黄碱、甲基麻黄碱含量的RSD分别为1.0%、0.9%、1.3%、1.5%（n=6），表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率考察

分别精密吸取“2.1.1”项下混合对照品储备液（含麻黄碱34.470 μg/mL、伪麻黄碱35.355 μg/mL、去甲伪麻黄碱3.223 μg/mL、甲基麻黄碱9.972 μg/mL）0.2、0.4、0.6mL，分别置于50 mL量瓶中，加含1%甲酸的甲醇稀释至刻度，摇匀，制得低、中、高质量浓度的混合对照品溶液。精密称取已知含量的半夏露颗粒样品（批号191003088）9 份，每份约0.1 g，分别精密加入上述低、中、高质量浓度混合对照品溶液10 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果显示，各成分的平均加样回收率分别为99.13%、100.87%、98.45%、95.75%，RSD分别为1.1%、1.2%、1.0%、1.7%（n=9），表明方法准确度良好。结果见表3。

2.9 样品测定

取半夏露颗粒样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，平行制备2 份，按“2.2”项下条件进样测定，记录峰面积并按外标法计算各成分含量。结果显示，麻黄碱、伪麻黄碱、去甲伪麻黄碱、甲基麻黄碱的含量分别为20.62～26.02、20.96～24.90、2.26～2.63、5.36～6.32 μg/g，详见表4。

3 讨论

3.1 提取条件的选择

本课题组前期考察了乙腈、甲醇、含1%甲酸的乙腈、含1%甲酸的甲醇对半夏露颗粒中4 种麻黄碱类成分的提取情况。结果显示，含1%甲酸的甲醇的提取效果好、回收率高且共提物较少，故将其作为提取溶剂。麻黄碱类成分作为小分子生物碱，极性大、碱性强，在极性较大的甲醇中的溶解性更优，而甲酸的加入将更有利于碱性物质的提取;此外，无水硫酸钠可去除基质中的水分，并可起到一定的蛋白盐析沉淀效果。

3.2 净化条件的选择

半夏露颗粒是由各药材经清炒、渗漉、煎煮等流程，将所得清膏与10 倍量的蔗糖拌匀后所制，成分复杂且含糖量较大。本课题组前期尝试用甲醇直接超声提取不作前处理，但所得供试品溶液颜色较深且含有大量杂质，多次进样后发现，质谱离子源锥孔处存在明显污染。虽然，串联质谱以MRM模式的专属性较好，杂质不出峰，但长期分析未经净化的样品，会造成质谱对待测物的响应减弱，影响测定的准确度[17]。研究指出，QuEChERS 中的PSA 可通过氢键作用而除去糖、色素、有机酸等成分，C18则可有效去除油脂、甾醇等小极性化合物[18-19]。本课题组实践结果显示，QuEChERS前处理方法可以有效净化供试品溶液，将棕褐色的甲醇提取液净化成澄清近无色的液体，除去了大量杂质，有利于减少质谱离子源所受污染，提高检测的准确度。本课题组通过优化PSA 和C18的用量发现，采用PSA 100 mg、C18 50mg净化4 种麻黄碱类成分的平均回收率最高，提取净化效果最优，所得供试品溶液澄清近无色，故选用该组合作为本研究所用的QuEChERS净化剂。

3.3 色谱、质谱条件的选择

4种麻黄碱类成分均为小分子强碱性物质，且麻黄碱与伪麻黄碱为一组同分異构体，两者的一级母离子与二级碎片离子完全相同，须通过适当的色谱条件进行有效分离。本课题组通过对Phenomenon Luna C18（2.0 mm×150 mm，3 μm）、Agilent XDB C1（8 4.6 mm×50 mm，1.8 μm）2 种色谱柱的分离情况进行考察发现，Agilent XDB C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）对4 种待测成分有很好的保留和分离效果。本课题组根据色谱图比较不同流动相体系的分离效果发现，添加乙酸铵可改善色谱峰峰形，添加甲酸可增强4 种麻黄碱类成分的离子化效果和质谱响应，最终采用5 mmol/mL 乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）-乙腈作为流动相体系。此外，本课题组还优化了离子源的电气参数、解簇电压、裂解电压等质谱参数，流动相梯度、流速、柱温、进样量等色谱参数，最终得到了响应较强、分析时间较短、色谱峰峰形较好的质谱与色谱条件。

综上所述，本实验采用QuEChERS方法净化供试品溶液，采用UHPLC-MS/MS法在22 min 内同时测定了半夏露颗粒中4 种麻黄碱类成分的含量，所用样品前处理方法简便，定量分析方法专属性强、灵敏度高、分析成本低且检测结果可靠。相比直接经甲醇提取后进样分析，本法有效地减少了质谱离子源污染，适用于大量样品的快速分析，并可为成分复杂的中药成方制剂质谱分析和质量控制提供一定的参考。