大米中三种香兰素的GC-MS分析方法

刘莉，周相娟*，钟丽君

国家食品质量安全监督检验中心（北京 100094）

香兰素是一类人工合成的香精，通常分为甲基香兰素和乙基香兰素，具有香荚兰香气及浓郁的奶香，广泛用于食品、饮料以及日化用品[1]。香兰素及其衍生物甲基香兰素和乙基香兰素是香料工业中重要的品种，因具有增香、抑菌、抗氧化、医药中间体等作用，在食品、化妆品、饲料、医药等方面用途广泛[2-4]。我国国标GB 2760—2014[5]中香兰素是允许使用的食品用合成香料。但有研究指出，食用香兰素含量过多的食品可能会对肝、肾、脾等脏器产生副作用，同时香兰素含量过多会影响食品的口感，导致头晕、恶心等不适症状[6]，因此食品中香兰素的含量是评价食品安全的一个重要指标。

目前关于香兰素和乙基香兰素的测定方法主要有分光光度法[7-9]、电化学法[10-13]、高效液相色谱法[14-17]。鲜有文献用气相色谱质谱联用对大米中甲基香兰素、乙基香兰素、香兰素同时测定的报道。为了解香米中香料的添加情况，我们对大米中三种香兰素含量进行研究，通过优化前处理条件和色谱条件，实现了对大米中三种香兰素的同时测定，为我国食品的质量安全提供了一种灵敏、准确、快捷的检测方法，对保障消费者权益和人体健康具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

安捷伦6890A-5973气相色谱质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；Vortex-genie2漩涡振荡器（美国Scientific Industries）；CH-30L超声提取仪（北京国环高科自动化技术研究院）；5810R低温离心机（美国Eppendorf 公司）。

标准品：香兰素，甲基香兰素，乙基香兰素，纯度均大于99.9%，北京振翔科技有限公司。乙酸乙酯：色谱纯，美国Fisher公司。

1.2 样品前处理

称取1 g大米于50 mL离心管中，加入5 mL蒸馏水超声提取30 min，取出后加入5 mL乙酸乙酯，涡旋震荡30 min，以8 000 r/min低温离心后取上清液上机进行测定。

1.3 色谱质谱条件

色谱柱：HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）或性能相当者；载气是高纯氦气，纯度＞99.999%，载气流速：1.0 mL/min，恒流模式；采用程序升温：色谱柱初始温度100 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min的速率升至220 ℃，最后在220 ℃保持4 min；再以40 ℃/min的速率升至250 ℃，保持8 min；进样方式：不分流进样：进样体积1 μL。

质谱条件：电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；传输线温度：280 ℃。离子源温度230 ℃；溶剂延迟时间8 min；选择离子检测模式（SIM），具体见表1。

表1 三种化合物的保留时间和检测离子

1.4 标准溶液的配制

用乙醇配成各组分质量浓度为1.0 mg/L的混合标准使用液。

2 结果与分析

2.1 样品前处理的优化

2.1.1 提取溶剂的选择

目标化合物的有效提取是大米中甲基香兰素、乙基香兰素、香兰素检测的前提。称取1 g样品，研究比较了二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、乙腈的提取效果，结果如表2所示，乙酸乙酯和乙腈的提取效果差不多，但乙腈提取的基线噪音比较大，因此选用乙酸乙酯作为试验的提取试剂。不同溶剂提取率见表2。

表2 不同溶剂对三种香兰素的提取率 单位：%

称取1 g样品，研究比较了直接乙酸乙酯提取和水浸溶后乙酸乙酯提取两种方法的提取效果。结果表明，两种方法的提取回收率都可达到90%以上。由于水浸润后的大米几乎都有香兰素检出，因此选用阳性样品进行不同加水量提取效率的比较分析。结果表明添加1，2，3，4和5 mL的水量，测定结果没有显著变化，水的添加仅能促进乙酸乙酯对大米中香兰素的提取。

2.1.2 提取方式的优化

我们比较了涡旋振荡和超声两种方式对阳性样品的提取效果。结果表明超声提取效果明显优于涡旋振荡。

比较了5，10，15，20和25 min不同超声时间对三种化合物的提取效率。结果表明：随着超声时间的延长，乙酸乙酯对三种化合物的提取回收率增加，时间到达20 min以上时，提取效率未表现出明显的变化，本研究最终确定超声提取时间为25 min，以保证样品充分提取。

2.2 色谱柱的选择

试验比较了HP-5、HP-1701和HP-INNOWAX三种不同极性毛细管色谱柱对香兰素的响应和分离度效果。结果表明，上述色谱柱对三种香兰素都有响应，但是响应大小有差异：香兰素在极性的HP-INNOWAX色谱柱中响应最好。故研究选用HP-INNOWAX毛细管柱来进行分离。通过对色谱条件的进一步优化，发现在HP-INNOWAX条件下，香兰素与杂质能有效分离且目标峰峰形良好，阳性样品和标准溶液中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素的色谱图见下图1和图2。

图1 阳性样品的选择离子流图

图2 三种香兰素标准溶液的选择离子流图

2.3 方法的精密度与回收率

对6个品牌的大米样品分别进行3次平行处理和分析检测，对于香兰素每个品牌都有检出，范围在78～210 μg/kg，而甲基香兰素和乙基香兰素均未有检出。其检测结果及相对标准偏差见表3。

表3 6个品牌大米的分析结果

准确称取空白样品18份，平均分为3组，分别定量加入20，100和200 μg/kg的香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的混合标准溶液，进行6次平行处理和分析检测，样品检测结果及加标回收率见表4。从表4可以看出不同浓度的平均方法回收率在94.3%～99.6%，平均相对标准偏差在0.19%～3.03%（n=6）。

表4 方法回收率和精密度（n=6）

2.4 方法的检出限

根据国际纯粹和应用化学联合会（IUPAC）对检出限的定义，稀释并检测系列混合标准溶液，计算信噪比（S/N）。以S/N=3为检出浓度，以S/N=10为最低定量浓度。向不含目标物质的样品中定量添加混合标准溶液，按前处理方法处理后，进行检测，计算信噪比（S/N）。以S/N=3为检出限，以S/N=10为定量下限。由此分别得到3种目标物的方法检出限和定量限。按称样量为1.00 g，最终定容5 mL，方法中三种香兰素的最低检出质量分数均为15 μg/kg，最低定量质量分数均为50 μg/kg。香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素的检测限、定量限见表5。

表5 三种化合物的检出限和定量限

2.5 方法的线性关系

标准系列工作液：分别准确吸取不同体积的混合标准储备液（1 mg/mL），将其稀释成香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素质量浓度分别为10，20，40，100，200，400和1 000 μg/L的标准系列工作液。按浓度由低到高分别进样1 μL，测定结果经线性回归，回归方程（Y为峰面积，x为质量浓度，μg/L）在10～1 000 μg/L范围内线性均良好，香兰素的线性方程为y=23.63x-50.01；r2=0.999 8。甲基香兰素的线性方程为y=50.05x+605.2；r2=0.998 9乙基香兰素的线性方程为y=44.54x+188.0；r2=0.999 9。

3 结论

方法通过对气相色谱条件和质谱条件的优化，以及前处理方法的研究，建立了同时测定大米中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的检测方法。运用该方法对市售30个批次大米中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素进行分析，得到了满意的结果。相比于固相萃取方法操作繁琐、耗时，无法满足大批量样品快速检测的特点，本方法采用乙酸乙酯提取，超声提取，快速、简便和高效，试剂耗材用量少，能节约检测成本，提高检测效率。相比于液相色谱法、气相色谱法，灵敏度更高，基质干扰小，无需衍生化即可对三种常用香料进行同时测定，有效提高了检测速度和检测效率，为食品安全性监管提供技术支撑。