云南省边境地区牛阿卡斑病毒血清学调查

寇美玲，谢佳芮，苗海生

（云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224）

阿卡斑病毒（Akabane virus，AKAV）属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）正布尼亚病毒属（Orthobunyavirus）辛波（Simbu）血清群，是一种通过库蠓、蚊虫等节肢动物传播的虫媒病原，最易感染妊娠期的牛和羊，也可感染马、猪和骆驼[1-5]，广泛流行于亚洲、大洋洲和非洲的热带、亚热带及温带地区[6]，可导致妊娠母畜流产、早产，产死胎，并可通过胎盘垂直传播，侵害胚胎中枢神经系统，导致新生牛羊出现积水性无脑症和先天性关节弯曲等症状，对牛羊养殖业的健康发展构成较大威胁。1959 年AKAV 首次在日本群马县赤羽村被发现，随后在澳大利亚、韩国、南非和以色列等国家被相继报道发现[4-5，7-8]。近年来，我国云南、广西、广东、贵州、四川等省（自治区）也有AKAV 相关血清学调查、病毒核酸检测的报道，提示这些地区的家畜中可能有AKAV 流行[9-12]。

云南省位于我国西南部，有多个县市与老挝、缅甸、越南等国家接壤且缺乏自然屏障，接壤县市之间贸易往来频繁，每年有大量家畜通过边境县市进入我国境内，且边境县市大多属于热带、亚热带气候，温差小，雨量充沛，适宜媒介昆虫的生长繁殖，更有利于AKAV 传播，因此防控边境地区AKAV感染对于保障云南省家畜养殖业健康发展具有重要意义。为了解云南省边境地区牛群的AKAV 感染情况，本研究采用C-ELISA 方法对采自云南省边境县市的牛血清样品进行AKAV 抗体检测，并对不同来源、不同年份、不同品种、不同地区、不同饲养方式牛群的抗体阳性率进行统计分析，初步评估云南省边境地区牛群AKAV 流行风险，以期为云南省边境地区AKAV 感染相关防控政策的研究与制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2019—2020 年，每年的1—9 月从云南省边境地区10 个县市（芒市、瑞丽、景洪、勐海、勐腊、富宁、孟连、西盟、江城、沧源）197 个场点采集牛血清样品4 437 份，其中入境牛2 644 份、本地牛610份，其余1 183份背景信息不详。在每个县市，按照采样点所属地理位置划定区域，将区域内养殖场、活畜交易市场和散养户编号，根据所在区域实际情况，按比例随机抽取养殖场1～4 个、活畜交易市场1～2 个、散养户1～20 个；场户内根据存栏量，以颈静脉采血方式，按比例随机采集牛血清样品。采样地点选择雨量多、日照长、湿度大，适于媒介昆虫生长和繁殖的热带、亚热带地区。具体采样信息见表1。

表1 2019—2020 年云南省边境地区10 个县市采样场户数

1.2 主要试剂

AKAV C-ELISA 检测试剂盒[13]、PBSTM（磷酸盐缓冲液+Tween 20+脱脂奶粉），为云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室制备；脱脂奶粉，购自BD difco 公司；PBS 干粉、Tween 20，均购自云南丰科生物科技有限公司。

1.3 血清抗体检测

利用云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室研制的AKAV C-ELISA 检测试剂盒，对样品进行血清抗体检测。取出试剂盒提供的ELISA 板，各加入12 μL 待检血清以及阴阳性对照血清到相应检测孔和对照孔，每孔加入50 μL 1/100 稀释的豚鼠竞争抗体，震荡混匀，37 ℃温育1 h；PBST 洗板3 次，吸水纸上拍干；每孔加入50 μL 1/1 000 稀释的兔抗豚鼠HPR，37 ℃温育30 min；洗板5～6次拍干，加入TMB 显色液50 μL/孔，37 ℃避光温育10 min；加入终止液50 μL/孔，用ELISA 读板仪450 nm 波长测定样本和对照的吸光值A450。试剂盒质控标准：两个阳性对照孔A450≥0.8，两个阴性对照孔A450≤0.3。判定标准：按照抑制率（PI）=（1-样品血清A450/阴性对照A450平均值）×100%；抑制率≥40% 时判为阳性，＜40%时判为阴性。

1.4 统计分析

将各地检测的AKAV 抗体阳性率，采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 地区分布

地区统计结果（表2）显示：在边境地区10 个县市采集的4 437 份牛血清样品中，共检出1 367 份抗体阳性血清样品，平均抗体阳性率为30.81%；10 个县市均检测到抗体阳性样品，其中勐腊、沧源、富宁、江城、景洪等县市抗体阳性率较高，每年的抗体阳性率和场户阳性率均在30%以上，而瑞丽、西盟较低，均在25%以下，差异存在统计学意义（P＜0.05）。结果表明，云南省边境地区存在一定范围的牛AKAV 感染，且地区间存在一定差异。

2.2 时间分布

2019 年平均抗体阳性率为27.88%，2020 年为32.14%，呈现增高趋势，但差异不显著（P＞0.05），每个地区的抗体阳性率均呈现增高趋势（表2），但除富宁县2019、2020 年抗体阳性率差异显著（P＜0.05）外，其余县市差异均不显著（P＞0.05）。2019 年平均场户阳性率为38.81%，2020年为36.92%，呈现降低趋势，但差异不显著（P＞0.05），大多数县市的场户阳性率也表现降低趋势。

2.3 群间分布

2.3.1 不同来源 不同来源样品统计结果（表3）显示：每年的入境牛抗体阳性率均显著高于本地牛（P＜0.05），且入境牛、本地牛以及来源不详牛的抗体阳性率均呈增加趋势。

表3 不同来源牛AKAV 血清抗体检测结果统计

2.3.2 不同场户 不同场点统计结果（表4）显示：每年的养殖场抗体阳性率均高于散养户和交易市场，但差异不显著（P＞0.05）；每年均从3 个活畜交易市场中检出阳性样品，场户阳性率均为100%，与养殖场和散养户差异存在统计学意义（P＜0.05）。

表4 不同场点AKAV 血清抗体检测结果统计

2.3.3 不同饲养方式 不同饲养方式的统计结果（表5）显示：舍饲牛群的AKAV 抗体阳性率最高，系牧饲养次之，半放牧半舍饲最低；舍饲与其他饲养方式相比，抗体阳性率差异存在统计学意义（P＜0.05）。

表5 不同饲养方式牛群的AKAV 抗体检测结果统计

2.3.4 不同品种 不同品种的统计结果（表6）显示：不同品种牛均可感染AKAV，2019、2020 年黄牛抗体阳性率分别为30.03%，34.03%，水牛分别为10.89%、17.20%，黄牛显著高于水牛（P＜0.05）。

表6 不同品种牛的AKAV 抗体检测结果统计

3 讨论

AKAV 是一种通过媒介昆虫传播的病毒，主要造成反刍动物繁殖障碍和先天性畸形。1998 年李其平等[14]从上海市采集蚊、蠓等标本，首次分离到AKAV；2007 年Wang 等[15]对我国24 个省（直辖市）2006—2015 年的血清样品进行AKAV中和试验，结果在23 个省（直辖市）检测到抗体，牛阳性率为21.3%，羊为12.0%，说明我国牛羊中存在一定的AKAV 感染。我国近年来仍不断有分离到AKAV 的报道[9-11]。到目前为止，针对AKAV感染没有有效治疗方法，因此开展AKAV 血清学调查对其流行的控制极为重要。

本研究所选的10 个县市与老挝、越南、缅甸接壤，均处于亚热带、热带地区，平均气温高，降雨多，适宜蚊、蠓等媒介昆虫生长繁殖，利于AKAV 传播，具有地域代表性。由于国内牛、羊等易感动物目前均未接种AKAV 疫苗，田间动物没有疫苗接种干扰，因此血清学方法对于AKAV 感染的流行病学调查具有重要意义。对比常用的血清学方法，中和试验重复性误差大，血凝抑制、琼脂扩散和补体结合试验敏感性低[16-17]，而ELISA 方法检测结果更为准确。本研究对云南省边境地区10 个县市牛群进行AKAV 血清学调查，初步摸清了这些地区的AKAV 流行本底，揭示了云南省边境地区牛群存在不同程度的AKAV 感染。10 个边境县市的AKAV 抗体阳性率存在一定差异，也可能与采集血清样品的时间、样本数量及场户等差异有关。对本地和入境牛的检测结果进行统计发现，入境牛AKAV 抗体阳性率明显高于本地牛，提示与其接壤国家的边境地区AKAV 流行可能较为严重，对我国本地牛群威胁较大。因此，应加强海关检疫，在邻近地带，定期进行防虫、杀虫，切断AKAV 传播途径。

养殖场的抗体阳性率高于散养户和交易市场，这可能与大部分养殖场采取舍饲的饲养方式有关。活畜交易市场两年内均检测到抗体阳性，场户阳性率达到100%，病毒扩散风险较高，因此应加强流通监管。舍饲牛群抗体阳性率明显高于半放牧半舍饲和系牧饲养方式牛群，其原因可能是密集型饲养更易于牛群间相互感染，且舍饲下牛群运动相对较少，对病毒的抵抗力较弱。黄牛和水牛均可感染AKAV，但黄牛的抗体阳性率明显高于水牛，但由于水牛样品采集数量相对较少，牛品种与AKAV感染之间的关联性需要进一步加大样本量来验证。研究发现，AKAV 感染有加重的趋势，需要加强监测和控制。

本研究对云南省边境地区进行了牛AKAV 血清学调查，初步探究了边境地区牛群AKAV 感染的分布情况及其特点，为今后本病防控提供了重要的流行病学依据。

4 结论

对云南省10 个边境地区进行牛AKAV 血清学调查发现，云南省边境地区存在一定的AKAV 感染且有加重趋势，入境牛感染显著高于本地牛。提示相关部门需重视对边境地区AKAV流行的控制，持续开展血清学调查和监测，加强境外牛群入境检疫，降低AKAV 从边境地区向内地扩散的风险。