分光光度法测定地表水中叶绿素a的进一步研究

王一会，王志瑞，吴德景，郭 莹

(安顺生态环境监测中心，贵州 安顺 561000)

叶绿素a本身对环境没有危害，但它是估算浮游植物生物量的重要指标[1]。在环境监测中，叶绿素a含量是评价水体富营养化的指标之一，是国家地表水环境质量监测网采测分离分析中必测项目之一。通过测定水中浮游植物叶绿素a的含量，可以掌握水体的初级生产力情况和富营养化水平[1]。

目前已经报道的叶绿素a测定方法有高效液相色谱法、荧光光度法和分光光度法，但由于高效液相色谱仪价格昂贵、分析操作繁杂，荧光光度法易受其它色素或者色素衍生物的干扰等均不便原因，使得前两者于进行大规模的野外测试，故而最常使用的多为分光光度法[2]。

已有的报道中，对叶绿素a的提取，部分研究采用了不进行研磨的处理方法，如超声破碎法[3]和液氮冻融法[4-5]等。但国家所有的权威标准方法均需要进行研磨处理。研磨操作存在条件不容易控制、叶绿素a易流失导致分析测试结果偏低；溶剂易挥发使得操作者身体受到伤害的同时也污染环境；且研磨耗时的缺点使得该法在测试大量样品时存在分析耗时周期长、样品中叶绿素a流失等诸多弊端。本研究拟在已有相关标准[6-7]和报道[8]的基础上，结合实验室已有条件，初步探究分光光度法测定地表水中叶绿素a的更优条件。

1 材料和仪器设备

水样样品，安顺市水源点；丙酮，成都诺尔施科技有限责任公司；碳酸镁，国药集团化学试剂有限公司；乙酸纤维滤膜(直径50 mm，孔径0.45 μm)，上海兴亚净化材料厂；GM-1.0A隔膜真空泵，天津沸腾实验设备有限公司；玻璃砂芯过滤装置，天津沸腾实验设备有限公司；T9紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；LD-5型电动力离心机，贵州荣华仪器制造有限公司；Ar 1140电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；实验室常用仪器设备。

2 实验部分

(1) 采用分光光度法测定水质中的叶绿素a，参考HJ 897-2017 《水质 叶绿素a的测定 分光光度法》。以安顺市水源点的地表水为分析样品、提取试剂为90 %丙酮、滤膜为0.45 μm乙酸纤维滤膜、样品保存方法为每升水中加入1 mL碳酸镁悬浊液于0～4 ℃避光保存，24 h内分析，滤膜直接放入带塞刻度离心管中，用吸管加入90 %丙酮，定容至10 mL，放置于-20～0 ℃避光浸提，浸提过程中剧烈摇晃1～2次，浸提时间为4～12 h，然后以3500 r/min离心10 min，用针式过滤器过滤，以90 %丙酮为参比，用3 cm比色皿于波长750、664、647、630处测量吸光度并计算叶绿素a含量，实验结果见表1和 表2。

表1 空白样品多次测定结果Table 1 The results of blank samples were tested for several times

表2 研磨与不研磨的测定结果比较Table 2 Comparison of measurement results between grinding and non-grinding

(2) 将同一样品用(1)所描述方法进行叶绿素a的提取，后分别用1 cm和3 cm光程比色皿进行测定，比较测定结果，该对比实验以两个样品为供试对象，实验结果见表3。

表3 不同光程比色皿测定结果Table 3 The results of different water samples were determined by different cuvettes

3 实验结果与讨论

3.1 实验结果

3.1.1 与现有环保部标准方法的检出限作对比研究

对空白样品进行7次平行测定，计算测定结果的标准偏差，结果见表1。

由表1 中数据计算出：检出限MDL=t(n-1，0.99)× S = 0.00011 × 3.143 mg/L = 0.0004 mg/L，该值低于环保部规定的0.002 mg/L，满足国家环保标准的要求。

3.1.2 研磨与不研磨的比较

测定同一水样经直径为50 mm，孔径为0.45 μm的乙酸纤维滤膜过滤后，分别采用玻璃研钵手工研磨和不研磨的方式对其中的叶绿素a进行提取，测定结果如下：

t检验结果表明采用研磨和不研磨两种方法对测定结果有显著差异，说明研磨过程中叶绿素a有损失。本次实验中叶绿素a测定时的损失量为4%～25%。

3.1.3 不同光程下吸光度的比较

由表3可以看出：将比色皿光程由1 cm换成3 cm后，样品8和9在A750、A664、A647和A630处的吸光度均大幅度提高，初步表明改用3 cm比色皿可以提高分光光度法测定地表水中叶绿素a的吸光度，进而提高该方法的灵敏度。

3.2 讨 论

(1) 实验结果表明：本研究通过结合低温冻融和超声破碎法，使用改进后的方法，对叶绿素a进行提取，该方法减少了提取过程中叶绿素a的损失，更加准确的反映了样品中叶绿素a的含量。同时该操作提高了工作效率、降低了分析人员的工作强度，也减少了试剂和玻璃器皿的消耗。

(2) 国家标准[6-7]中提到：该法使用的比色皿的长度为 1 cm，根据多年对贵州省内叶绿素a的测定发现，A664波长处的吸光度最大，但是吸光度均小于0.100；再结合标准[7]中指出：分光光度法选择比色皿的光程长度应视所测溶液的吸光度而定，以使其吸光度落在0.1～0.7之间为宜。所以本研究通过改用3 cm的比色皿进行测定，提高了吸光度，进一步降低了测定误差和检出限。

4 结 论

本研究通过改进样品中叶绿素a的提取步骤和改变比色皿的量程。可有效提高水中叶绿素a的测定效率，减少了试剂和玻璃器皿的消耗，减少了叶绿素a测定过程中的损失，更加真实的反映了环境中叶绿素a的含量，保障了人民群众的环境知情权；同时也降低了方法检出限，为更精确测定叶绿素a提供了方法依据，也可为叶绿素a标准测定方法的建立提供一定参考价值。