强化阿托伐他汀治疗对PCI患者EMPs、Th17/Treg水平及Notch1信号通路的影响

陈园月,陆永光,陈丽媛，黄军章，陈 林，仇昌智 (钦州市第二人民医院心内科，广西 钦州 535099)

越来越多的研究表明急性冠状动脉综合征(ACS)的进展过程中存在急慢性炎性反应及病理性免疫反应[1]，炎性及免疫细胞的过度激活与血管内不稳定性斑块密切相关[2-3]。经皮冠状动脉介入治疗(PCI)是治疗ACS的有效方法，手术后存在的心肌损害仍是棘手问题。EMPs的功能与内皮细胞有关，它可以通过作为细胞介质和黏附分子的载体来转导细胞信号[4]。有研究表明，ACS患者EMPs表达增多[5]。 哺乳动物的Notch信号通路由4种Notch受体(Notch1～4)和5种配体(Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4)组成，当配体与受体胞外区结合后，发生酶切，然后经Y-分泌酶二次酶切，激活相关基因的表达。研究发现Notch信号通路可加重内皮细胞衰老及炎性反应[6]。于是提出Notch信号与动脉粥样硬化有关。巨噬细胞在动脉硬化进展中扮演着中心角色。研究表明，激活的巨噬细胞通过介导 Notch1 及其下游目标基因和炎性效应因子而参与促炎反应，从而具有促进ACS发生的作用[7]。但目前还没有Notch信号通路与EMPs关系的相关具体研究。本研究旨在探讨两者之间关系。

阿托伐他汀是冠心病的主要治疗药物，效果显著，但其对Th17/Treg及Notch1信号通路的影响研究较少。本研究观察了ACS患者外周血Th17、Treg变化及Notch1受体变化，探讨阿托伐他汀治疗对Th17、Treg的作用及EMPs诱导CD4+T淋巴细胞亚群分化和效应分子的表达机制和EMPs与Notch1信号转导通路的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取2017年2月～2018年1月本院收治的ACS患者112例为研究对象。纳入标准：包括不稳定性心绞痛及急性心肌梗死并择期行PCI术的患者。排除标准：既往有脑卒中、近1个月内使用非甾体抗炎药、激素、免疫抑制剂或他汀类药物；合并肝肾功能障碍、免疫及风湿性疾病或肿瘤；合并感染性疾病或发热；妊娠及哺乳期妇女。将患者随机分为阿托伐他汀强化治疗组(强化组)和阿托伐他汀常规治疗组(常规组)各56例。本研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2治疗方法：强化组和常规组均积极控制基础疾病，给予冠心病二级预防常规治疗等。在此基础上强化组口服阿托伐他汀钙片术前服用 80 mg/d，术后服用40 mg/d，而常规组术前、术后服用20 mg/d。

1.3血清Treg、Th17检测：强化组及常规组分别于术前、术后1周抽取静脉血，制备单淋巴细胞悬液，采用流式细胞仪(美国BD 公司)检测 Th17、Treg，计算 Treg/Th17。

1.3.1单淋巴细胞悬液制备：将标本加入分离液中，离心0.5 h，使用PBS洗涤细胞，然后液氮保存。

1.3.2Th17检测：解冻淋巴细胞，经培养及加入抗体孵育后，采用流式细胞仪检测Th17，计算比例。

1.3.3Treg检测：于单细胞悬液加入抗体，经破膜及孵育后，采用流式细胞仪检测Treg。

1.4ROR-yt mRNA、Foxp3 mRNA、Notch1 mRNA水平表达检测：采用逆转录PCR法。取各组样本，采用TRIzol法提取总RNA；合成第一链cDNA；构建荧光定量PCR 反应体系。反应条件为95℃2 min、95℃ 20 s、60℃ 30 s、68 ℃ 55 s(40个循环)。以 GAPDH 为 内参，计算ROR-yt、Foxp3 mRNA Notch1 mRNA相对表达量。ROR-yt 上游引物：CCTGGGCTCCTCGCCT-GACC，下游引物：TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC。Foxp3上游引物：CTGGCAAATGGTGTCTGCAAGT，下游引物：TGGCACCCAGCACAATGAA。Notch1基因引物序列上游引物ACAGCCTCAACGGGTACAAG，下游引物GGCAGACACAGGAGAAGCTC。

1.5IL-17检测：取1.4标本离心后取血清，按试剂说明书，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-17。

1.6EMPs检测：在患者入院后次日清晨空腹及术后1周时采取患者外周静脉血抽取患者3 ml，离心后获取含血小板的血浆。取50 μl血小板血浆加入特异性标记抗体0.5 μg或等量的同型对照抗体(鼠IgG1/PE，鼠IgG1/FITC，美国BD公司生产)。在室温下孵育20 min后加用PBS后，用流式细胞仪检测。检测过程在血样收集后4 h内完成。EMPs定义为直径<1.0 μm且CD31+/CD42-的微粒。

1.7统计学方法:采用SPSS17.0统计学软件进行t检验与χ2检验；两组间比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1两组Th17、Treg表达的比较：与术前比较，术后Th17下降，差异有统计学意义(均P<0.01)。与常规组比较，强化组Th17降低，差异有统计学意义(均P<0.01)。与术前比较，术后Treg及Treg/Th17表达量升高，差异有统计学意义(均P<0.01)。与常规组比较，强化组Treg及Treg/Th17表达量升高，差异有统计学意义(均P<0.01)。见表1。

表1 两组Th17、Treg及Treg/Th17水平比较

2.2两组ROR-yt、Foxp3和Notch1 mRNA表达比较：与术前比较，术后ROR-yt、Notch1 mRNA下降；与常规组比较，强化组ROR-yt、Notch1 mRNA下降，差异均有统计学意义(均P<0.01)。与术前比较，术后(Foxp3) mRNA升高；与常规组比较，强化组(Foxp3) mRNA升高，差异均有统计学意义(均P<0.01)。见表2。

表2 两组血浆ROR-yt、Foxp3 mRNA、Notch1 mRNA表达水平比较

2.3两组EMPs、IL-17水平比较：与术前比较，术后EMPs、IL-17下降；与常规组比较，强化组EMPs、IL-17下降，差异均有统计学意义(均P<0.01)。见表3。

2.4相关性分析：结果显示EMPs与 Foxp3 mRNA水平均呈负相关，EMPs与Notch1 mRNA、ROR-yt mRNA和IL-17水平均呈正相关。

表3 两组EMPs、IL-17水平比较

3 讨论

Th17和Treg是来源相同，分化却不同的一组免疫炎性反应调控T细胞亚群，它们互相调节及抑制。Th17可分泌IL-17等多种细胞因子，激活病理免疫反应。有研究证实，Th17/Treg失衡在系统性红斑狼疮等免疫系统疾病发生、发展演变过程发挥重要作用[8-9]，本课题也充分体现了Th17/Treg失衡在ACS中发挥的重要地位。研究显示，动脉硬化模型小鼠的Th17及转录因子ROR-yt升高，说明Th17升高加速了动脉硬化进展[10]。既往试验表明ACS患者Th17及IL-17明显升高，说明Th17升高加剧了冠脉斑块的不稳定性[11]。而本次试验结论也符合该论点。Treg具有抑制免疫及抑制炎性反应的特性。Treg可分泌TGF-β和IL-10及抑制和下调炎性反应因子及单核细胞趋化因子表达，减少泡沫细胞形成及炎性细胞积聚，减轻动脉粥样硬化。Treg还可加快血脂分解，尤其低蛋白脂蛋白，下调血脂水平，抑制斑块内泡沫细胞增殖及血管内皮细胞活化[12]。

ROR-yt是Th17细胞的转录因子，诱导Th17细胞的分化和IL-17基因的转录。ROR-yt参与Th17介导的炎性反应免疫系统疾病的发生、发展，主要通过诱导Th17细分泌IL-17等细胞因子。Foxp3是Treg细胞的转录因子，Foxp3通过介导Treg分化、发育、表达而发挥重要免疫抑制作用。

不仅ROR-yt、Foxp3 会诱导Th17细胞及Treg细胞分化及相关细胞因子的转录。已有研究表明CD4+T细胞表达的Notch1细胞因子，也能够调控Thl7、Treg分化和免疫功能。本研究表明，上述CD4+T关键转录因子Notch1及其mRNA表达水平在ACS患者中均有改变，表明其不同程度参与了冠状动脉粥样硬化和粥样斑块不稳定的免疫调控。

在淋巴细胞发育原始阶段，Notch1受体可决定其向T、B细胞分化的命运[13]，Notch1在淋巴细胞的发育初期阶段有促进淋巴样前体细胞向T细胞分化，抑制其向B细胞分化的作用，而缺乏Notch1信号激活诱导的淋巴样前体细胞则会发育为B细胞。所以说Notch1在T细胞分化、发育过程中发挥重要作用，而且是Notch其他家属成员无法替代的。Zheng[14]研究发现，肾移植术后不同恢复程度的患者Th17细胞水平表达量明显不同，与Notch的表达量成正相关，提示在肾移植急性排斥反应中Th17细胞的增殖和分化与Notchl密切相关。而本试验ACS患者ROR-yt mRNA和IL-17也呈正相关。

有试验应用Notchl siRNA阻滞剂阻断Notch1信号通路，不但可以降低转录因子RORYt mRNA的表达，还能显著降低人类Th17细胞分泌的IL-17A、IL-17F 等细胞因子[15]，提示Notchl至少可通过转录因子ROR-yt 和IL-17基因启动子2个位点调控Th17细胞分化和功能。

本研究EMPs 与Notch1-mRNA、ROR-yt mRNA和IL-17呈正相关，因此，本研究推测EMPs诱导CD4+T淋巴细胞亚群分化和效应分子的表达可能通过对相应关键转录因子FOXP3和ROR-yt及Notch1信号通路的调控实现。CD4+T淋巴细胞亚群的效应分子还可反作用于CD4+T淋巴细胞，影响其分化和功能的发挥，它们之间存在着复杂的相互作用和调控网络。

本研究112例ACS患者，与治疗前比较，治疗后强化组Th17、IL-17水平、ROR-yt mRNA及Notch1-mRNA表达量均较治疗前及常规组治疗后降低，Treg及Treg/Th17、Foxp3 mRNA表达量较治疗前及常规组治疗后升高，EMPs 水平低于术前且强化组较常规组变化更明显，EMPs与Treg、Foxp3 mRNA水平均呈负相关。EMPs 与Notch1-mRNA、ROR-yt mRNA和IL-17呈正相关，提示急性冠脉综合征患者体内存在Th17、Treg失衡，强化阿托伐他汀通过下调Th17细胞IL-17及抑制Notch1表达纠正Th17/Treg失衡，而减轻ACS术后心肌炎性反应。

综上所述，阿托伐他汀通过下调EMPs水平有助于纠正Th17/Treg失衡，从而减轻炎性反应。同时Notch1信号通路由于对T细胞分化及发育中发挥重要生物学作用，其在动脉硬化形成发展阶段有重要影响，激活及加剧粥样斑块的炎性反应和斑块的不稳定性。使其成为新的药物作用靶。随着研究的深入，进一步阐明Notch1信号通路在疾病发生、发展中的分子机制，Notch1有望作为新的药物治疗靶点。