顶空-气相色谱法对芹菜中代森锌残留量的测定

刘 帅，张 欣，王嘉乐，陈 炎，唐雪妹，万 凯

(广东省农业科学院农业质量标准与监测技术研究所 广东省农产品质量安全风险评估重点实验室，广东 广州 510640)

代森锌作为乙撑双二硫代氨基甲酸盐(EBDCs)类保护性杀菌剂，能阻碍各种微生物的生长，广泛应用于蔬菜、果树、麦类和烟草等作物真菌病害，可防治花生叶斑病，马铃薯晚疫病，番茄早疫病，苹果树炭疽病和斑点落叶病等[1]。尽管代森锌属于低毒农药，但越来越多的研究表明代森类物质对人体具有较强的毒性机制，其残留物会受热分解成毒性较高的亚乙基硫脲(ETU)，有致甲状腺癌作用[2，3]，并通过富集和滞留作用进入生态系统。可见，代森锌农药在环境要素中，尤其是食用作物上的残留需要引起人们的重视[4]。

芹菜(ApiumgraveolensL.)作为一种高营养价值的小宗蔬菜，富含氨基酸、膳食纤维等营养元素和黄酮类物质、抗氧化剂等药理活性成分[5]，作为生长周期短、病虫发生重、用药频次高的“三棵菜”之一，其主要病害以真菌引起的芹菜软腐病和斑点病为主[1]，而代森锌作为保护性杀菌剂，在蔬菜的病虫害防治上发挥着重要作用。现阶段，国内外针对二硫代氨基甲酸盐类农药检测方法主要有分光光度法(Keppel法)、薄层层析法、毛细管电泳法、气相色谱法和液相色谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱串联质谱法等[6-8]，其中以气相色谱法最为普遍。我国GB 2763-2021上对代森类药物在农产品中的最大残留限量均以CS2计[9]，推荐检测方法为以气相色谱仪(ECD)为检测工具的SN 0139、SN 0157、SN/T 1541标准，原理是利用气密性注射器吸取上层二硫化碳(CS2)气体进行手动进样检测；另外，其他文献报道的使用气相色谱仪测定吸收了二硫化碳的正己烷溶液也是常用于检测代森类残留物的一种手段[10-11]。但以上方法处理过程中存在自动化程度低、平行性较差、基质效益、CS2/代森锌的质量转换系数不确定等问题。针对上述情况，本文研究以芹菜为供试对象，通过在密闭系统中与还原性酸溶液反应释放出CS2，利用自动顶空进样器吸取上层气体供气相色谱仪(FPD)测定的方式，建立了一种操作简单、快速高效、正确度和精密度均满足农药残留检测要求的分析方法，为代森锌的检测方法研究提供了科学的数据支持。

1 材料与方法

1.1 试剂 代森锌标准品(纯度>90%)；SnCl2.2H2O(分析纯)；浓盐酸(优级纯，36%～38%)；重蒸馏去离子水；氯化钠。

1.2 仪器 GC-2010Puls气相色谱仪，配备火焰光度检测器(S)；岛津HS-10顶空进样器；20mL顶空瓶(含聚四氟乙烯密封垫和密封铝盖)；电子天平；恒温干燥箱。

1.3 测定条件

1.3.1 自动顶空仪测定条件 炉温60℃，1mL定量环80℃，传输线90℃， 样品平衡15min，进样0.5min，GC 循环25min，加压时间0.5min，进样时间0.5min。

1.3.2 气相色谱仪条件 色谱柱：DB-624，60m×0.53mm×3μm，柱流量 5mL/min；进样口温度200℃，检测器温度250℃，不分流进样；升温程序：35℃保持5min，6℃/min升温至85℃，保持3min。

1.4 代森锌标准曲线配制

1.4.1 代森锌标准样品配制 准确称取代森锌标准品10mg(精确到0.01mg)，用蒸馏水稀释定容到10ml并摇匀，此时代森锌的质量浓度为1 000mg/L，并且每次使用前摇匀。使用蒸馏水将质量浓度为1 000mg/L的代森锌标准品逐级稀释成浓度为20、50、100、150、200、500、800、1 000μg/L的标准曲线分析液。

1.4.2 代森锌标准样品分析 取4.0mL标准曲线分析液放入到20mL装有2g NaCl的顶空瓶中，加入8mL SnCl2-HCl溶液，迅速盖紧瓶盖，放入80+2℃烘箱中酸解2h， 每隔20min摇1次。取出冷却至室温，供顶空-气相色谱仪(HS-GC-FPD(S))测定。在设定的气相测定条件下，以标准工作曲线各点代森锌浓度为横坐标，相对应测定的色谱峰响应值(峰面积)为纵坐标，绘制工作曲线。

1.5 样品分析 以匀浆后的芹菜基质作为供试对象，取4.0g试样于装有2g NaCl的20mL顶空瓶中，加入8mLSnCl2-HCl溶液，迅速压紧瓶盖后放入80+2℃烘箱中酸解2h， 每隔20 min摇1次。取出冷却至室温，供顶空-气相色谱仪(HS-GC-FPD(S))测定。

2 结果

2.1 空白试验 分别称取4.0g芹菜进行空白处理(图1-A)，0.1mg/kg浓度水平的添加回收试验(图1-B)，同时用等质量的蒸馏水代替芹菜试样进行同浓度水平的CS2添加试验(图1-C)。通过图1对比分析可知，在本方法条件下，CS2的保留时间为8.413min，而代森锌经过反应后，在相同的前处理方法和仪器条件下，CS2的色谱峰出峰时间为8.419min，并且所选基质中未检测出代森锌转化为CS2的农药残留。

2.2 工作曲线 本试验采用代森锌工作曲线的方法进行定量，以 CS2量代表代森锌残留量建立了代森锌工作曲线。结果表明，代森锌的浓度(x， μg/L)在20～1 000μg/L范围内与CS2峰面积(y)呈2阶多项式关系。由于代森锌在高浓度下的CS2峰面积显示较大，因此采用分段计算标准曲线方式进行定量，在20～200μg/L的曲线方程为y = 37.55x2+ 4 796.7x - 105 225(R2=0.998 2)；在100～1000μg/L的曲线方程为y = 298.6 x2- 114 128.1 x + 11 158 853(R2=1)。

2.3 方法正确度与精密度、定量限 称取4g空白样品，分别进行0.05、0.1、1.0 mg/kg的3个质量分数的添加回收率试验，按照1.4代森锌标准样品处理方法和1.5样品处理方法测定，分别计算回收率和相对标准偏差(RSD)。其中0.05和0.1mg/kg添加回收试验使用范围在20～200μg /L的标准曲线进行定量，1.0mg/kg的添加回收试验使用范围在100～1000μg/L的标准曲线进行定量，结果(表1)。可知，代森锌在芹菜中的回收范围为82.4%～103.4%，RSD范围为4.0%～5.2%，该方法正确度及精密度良好，可满足芹菜中代森锌残留的分析要求。按照最低添加浓度进行回收率试验，方法定量限为0.05mg/kg。

表1 芹菜中代森锌的添加回收试验结果

2.4 不同振荡间隔对CS2产出的影响 本方法在前处理过程中会产生CS2气体，并通过酸解振荡过程释放，但有关振荡间隔是否是提高CS2产出的研究报告较少。针对此现象，本研究分别考察了在80℃的0.1mg/kg添加浓度水平下，15、20、30、45、60min的不同振荡间隔对CS2产出的影响，结果(图2)，可知，合理的振荡间隔能增加CS2产出，当振荡间隔为<20min时CS2产出效果较高，>30min后，CS2产出存在显著性差异，因此本研究最终确度振荡间隔为20min。

图2 不同振荡时间对CS2产出的影响

2.5 样品测定 分别对不同来源的6份芹菜样品进行检测，检测结果(表2)。代森锌残留物在农贸市场环节抽取的一份样品中有检出，残留量为0.069mg/kg。

表2 不同来源芹菜中代森锌残留量

3 讨论

3.1 标准曲线的配制及转化率 代森锌标样为粉末状，不溶于大多数有机溶剂(甲醇、乙腈、丙酮等)，常见配制标样方式为固体配制(石滑粉、无水硫酸镁、硅藻土等)[9，10，12]或液体配制(去离子水，室温水中溶解度为10mg/L)[13]。为保证代森锌标准曲线与实际样品质量的一致性，本研究采用去离子水对代森锌标样进行稀释定容，并且每次使用前采用超声溶解5 min，添加标样时进行涡旋振荡，确保代森锌粉末在去离子水中分散均匀，此外顶空瓶的标准化瓶盖、压瓶器和耐压性也是决定试验成功与否的关键步骤。目前，代森锌在农产品上的农药残留含量是以测定酸解产生的二硫化碳的量来表述，这不可避免的需要测定代森锌在基质中的反应转化率(理论折算系数为1.81，回收率100%)，而研究表明，代森锌转化率随其含量的增加而降低，且在不同环境下的代森锌转化率并不相同，可能与反应试剂量和基质色素有关[14]。如代森锌在莴笋和叶用莴苣中的转化率分别为90.4%和92.0%，而在芹菜和芒果上的转化率可达到96.7%和97.0%[10，14，15]，由此可见，转化率的代入会给代森锌残留量的定量分析带来困难。针对上述情况，本试验以 CS2量代表代森锌残留量建立了代森锌的工作曲线，消除了由于CS2代森锌的质量转换系数带来的不确定性，对代森锌母体残留量的测定更加科学、可靠。

3.2 自动顶空进样的应用 除顶空进样检测方法外，文献报道的其他二硫代氨基甲酸盐类检测方法主要原理为溶剂吸收法，通常为在密闭的顶空瓶中添加正己烷溶液，目标农药与SnCl2-HCl溶液酸解，生成的CS2气体被正己烷吸收，后经火焰光度检测器(FPD)或电子捕获检测器(ECD)检测。虽然此方法比Keppel方法更加简单高效，但因为是溶剂进样，往往存在较强的基质效益，尤其是针对含油量高的作物，如花生、大豆、植物油等样品中的油脂类物质也溶于正己烷有机相，造成样品本底干扰和仪器污染，导致方法的重复性及精密度较差。秦曙[9]等人的研究表明，采用溶剂吸收法测定代森锰锌时，在花生中的数据相对标准偏差达到22%。另外，现行SN 0139等标准方法中进样方式为手动进样，易受到酸解后容器上层体积温度、平衡时间以及样品进样时间、速度的影响。而本试验以自动顶空进样器为基础，较好地解决了上述问题，实现了稳定进样，且前处理过程无需加入正己烷吸收CS2气体，有效地降低了基质效应的影响。

3.3 进一步研究方向 本文虽然探讨了不同振荡间隔对CS2含量的影响，结果显示当振荡间隔小于20min时产出CS2效果较好，但由于二硫代氨基甲酸酯类农药范围广泛，其处理后均以CS2形式存在，在气相色谱中难以区分其母体，目前也尚未出现利用气相色谱测定其中单一化合物的方法。近年来，前处理衍生化是对二硫代氨基甲酸酯类农药进行区分检测的重点研究方向，利用甲基化衍生原理检测其甲基化产物，有学者[16～18]研究用碱性EDTA溶液处理，使二硫代氨基甲酸酯的锌盐转变为水溶性钠盐，经碘甲烷烷基化后供气相色谱仪或液相色谱-串联质谱仪测定，虽然前处理较为繁琐，耗时长，但灵敏度和重现性好，可使代森盐类化合物在茶叶和水体中的定量限达到0.01mg/kg，且利用质谱手段能区分不同结构类型和杀菌剂母体及其代谢物，具有较好的研究前景。

4 结论

本文利用顶空进样-气相色谱火焰光度检测器(GC-FPD-S)建立了测定芹菜中代森锌残留量的方法，该方法通过自动顶空进样装置，更加方便简单，操作性强，正确度和精密度均满足农药残留分析要求，为芹菜中代森锌残留量的检测提供了新思路。