UPLC-MS／MS 法同时测定感冒清热颗粒中4 种成分

刘晓俊郭文婷沈鹏程龙

（1.昆明市食品药品检验所药品检验中心，云南 昆明650032； 2.昆明学院化学化工学院，云南 昆明650214； 3.上海爱博才思分析仪器贸易有限公司，上海200335）

感冒清热颗粒由荆芥穗、防风、柴胡、葛根、白芷等11 味药材组成，具有疏风散寒、解表清热的功效，方中葛根所含葛根素具有解肌退热、生津止渴［1］、抗炎、抗过敏［2-5］等作用；白芷所含欧前胡素具有解热镇痛、抗炎、平喘、抗菌等多种药理作用［6-11］；防风指标成分为升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷，前者具有镇静、抗菌、降压等作用，后者具有解热、镇痛、抗炎等多种功效［12-14］。2020年版《中国药典》 一部对感冒清热颗粒的质量控制以薄层鉴别为主，仅对葛根中葛根素含量采用HPLC 法进行测定，并未涉及升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、欧前胡素等其他有效成分，不能全面反映该制剂质量，而文献［13-21］也大多仅采用HPLC 法分别测定葛根素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、欧前胡素含量。本实验采用UPLC-MS／MS 法同时测定感冒清热颗粒中葛根素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、欧前胡素的含量，以期为全面评价该制剂质量、完善其标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290 超高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；AB SCIEX 三重四级杆／复合线性离子阱质谱仪（美国应用生物系统公司）；AL104 电子分析天平［万分之一，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；DV215CD 十万分之一微量分析天平（美国奥豪斯公司）；Chorus LC216-134 超纯水制备仪［威立雅水处理技术（上海）有限公司］；SONOREXRK 255 超声波清洗器（德国Bandelin 公司）。

1.2 试剂与药物 葛根素（批号110752-200912，纯度96.0%）、欧前胡素（批号110826-201616，纯度99.6%）、5-O-甲基维斯阿米醇 苷（批号111523-201208，纯度96.4%）、升麻素苷（批号111522-201008，纯度93.9%）对照品均购于中国食品药品检定研究院。3 批感冒清热颗粒分别来自广西维威制药有限公司（批号181214，含蔗糖，12 g／袋）、广东恒诚制药有限公司（批 号1811207，含蔗糖，12 g／袋）、葵花药业集团（冀州）有限公司（批号18022301，无蔗糖，6 g／袋）。甲醇、乙腈均为色谱纯；甲酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.9 μm）；流动相乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脱，程序见表1；体积流量0.2 mL／min；柱温35 ℃；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 质谱条件 SCIEX 4000 Q TRAP 三重四级杆／复合线性离子阱质谱系统；电喷雾离子源（ESI源），温度550 ℃，电压5.5 kV；正离子模式；喷雾气（Gas1）55 psi（1 psi ＝6.895 kPa）；辅助加热气（Gas2）55 psi；气帘气（CUR）30 psi，其他参数见表2。

表2 各成分质谱参数Tab.2 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.3 对照品溶液制备 精密称取对照品葛根素10.23 mg、升麻素苷10.07 mg、5-O-甲基维斯阿米醇苷10.04 mg、欧前胡素10.06 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为贮备液，分别精密吸取2 000、250、125、125 μL，置于同一250 mL 量瓶中，20%甲醇定容至刻度，摇匀，即得（各成分质量浓度分别为7 857.00、946.00、484.00、501.00 ng／mL）。

图1 各成分UPLC-MS／MS 色谱图Fig.1 UPLC-MS／MS chromatograms of various constituents

2.4 供试品溶液制备 取各批样品适量，研细，6 g／袋取约0.4 g，12 g／袋取约0.8 g，精密称定，置于50 mL 量瓶中，20%甲醇超声（频率33 kHz、功率250 W）处理30 min，冷却，20%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1.0 mL至10 mL量瓶中，20%甲醇定容至刻度，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.5 线性关系考察 精密吸取“2.3”项下对照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mL，置于10 mL 量瓶中，20%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列质量浓度，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。再以信噪比为10∶1 计算定量下限（LOQ），结果分别为葛根素8.27 pg、升麻素苷7.39 pg、欧前胡素5.22 pg、5-O-甲基维斯阿米醇苷5.63 pg；以信噪比为3∶1 计算检测下限（LOD），结果分别为葛根素2.48 pg、升麻素苷2.22 pg、欧前胡素1.57 pg、5-O-甲基维斯阿米醇苷1.69 pg。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度试验 取“2.5”项下对照品溶液（葛根素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、欧前胡素质量浓度分别为1 571.40、189.20、96.80、100.20 ng／mL），0.22 μm 微孔滤膜过滤，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定6次，测得葛根素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、欧前胡素峰面积RSD 分别为0.92%、1.29%、0.98%、1.32%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号18022301），室温下 于0、2、4、6、8、12 h 在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定，测得葛根素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、欧前胡素峰面 积 RSD 分别为 1.91%、1.46%、1.31%、1.73%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.8 重复性试验 取同一批本品（批号18022301）6份，每份约0.4 g，精密 称定，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定，测得葛根素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、欧前胡素含量RSD分别为1.41%、0.97%、1.18%、1.16%，表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 取各成分含量已知的同一批本品（批号18022301）6份，每份约0.2 g，精密称定，置于50 mL 量瓶中，精密加入“2.3”项下对照品溶液（982.08 μg／mL 葛根素1 000 μL、945.57 μg／mL 升麻素苷60 μL、967.86 μg／mL 5-O-甲基维斯阿米醇苷60 μL、1 001.98 μg／mL 欧前胡素300 μL），按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定，计算回收率，结果见表4。2.10 样品含量测定 取3 批样品各2份，其中批号18022301 约0.4 g，批号181214、1811207 各约0.8 g，精密称定，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”和“2.2”项条件下进样测定，计算含量，结果见表5。

表4 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表5 各成分含量测定结果（n＝2）Tab.5 Results of content determination of various constituents（n＝2）

3 讨论

3.1 测定方法选择 课题组前期采用HPLC 法测定感冒清热颗粒中葛根素、欧前胡素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量，发现欧前胡素色谱峰保留时间较长，含量较低，在供试品中未能检出；本实验采用UPLC-MS／MS法，上述4 种成分均能准确定量，并且具有分析时间短、准确度高、灵敏度高的优势。

3.2 流动相选择 本实验比较了甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸，发现以后者洗脱时保留时间短，各成分离子强度高，分离程度、峰形更理想，故以其为流动相。

3.3 含量分析 3 个厂家感冒清热颗粒中葛根素、欧前胡素含量稳定，均能达到药典标准，但升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷含量差异较大，分别达3.5、4.5倍，可能是药材质量差异、生产工艺不稳定所致，需引起关注。

4 结论

本实验建立UPLC-MS／MS 法同时测定感冒清热颗粒中葛根素、欧前胡素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量，该方法快速高效，灵敏度高，重复性好，可为完善该制剂质量标准提供参考。