天然产物及三氮唑类化合物与溴结构域BDR4的分子对接研究

孔祥薇，冯宇翔，张云红，戴 康

(中南民族大学 药学院，湖北 武汉 430074)

赖氨酸残基的乙酰化被认为在组蛋白的翻译后修饰中发挥关键作用[1]。人类基因组编码46种蛋白质，包含61个BRD，包括溴结构域和末端外(BET)蛋白质家族[2]。该BET家族包括四个蛋白：BRD2、BRD3、BRD4和BRDT(睾丸特异性表达，它们在调节RNA聚合酶II(Pol II)的转录方面发挥着不同的作用[3])。所有四种BET蛋白的共同点是两个保守的N端溴结构域(BD1和BD2)，它们是染色质相互作用模块，可识别组蛋白尾部和其他核蛋白上的乙酰化赖氨酸残基[4]。因此，BET蛋白是正常细胞和转化细胞中表观遗传信息的关键“阅读器”。

BET家族中研究最多的是BRD4，与其他BET蛋白的染色质结合特性一致，BRD4优先结合乙酰化组蛋白H3和H4，不同的是BRD4与染色质的结合在整个细胞周期中保持不变[5-6]。蛋白质组学分析表明BRD4与PTEFb相关，PTEFb是一种已知的RNA转录调节剂，能够通过磷酸化 RNA聚合酶II延伸复合物来激活暂停的RNA聚合酶II[7]。BRD4阻止 PTEFb与7SK/HEXIM相关联，从而使PTEFb保持其活性形式，从而实现RNA聚合酶II延伸和基因转录。因此，BRD4作为乙酰化组蛋白和基因转录之间的纽带。

BET蛋白被证实是竞争性抑制剂取代染色质中的溴结构域以影响基因表达变化的有希望的治疗靶点。因此，开发用于癌症治疗的新型BET抑制剂代表了寻找抗癌症药物的一种新思路。

1 实验部分

1.1 研究工具和材料

本研究采用Tripos的SYBYL-X2.1.1软件进行分子对接。使用ChemBioDraw绘制小分子结构，并用 ChemBio3D转换小分子的结构格式。7MLQ的蛋白质结构来自PBD数据库 (https：//www1.rcsb.org/structure/7MLQ)。

1.2 小分子配体文件准备

在PubChem Compound数据库中查找和三氮唑有一定结构相似性的药物如花青素(Anthocyanin)、苦参碱(Matrine)、喜树碱(Camptothecin)和紫杉醇(Taxol)结构。根据文献将26个4-甲基-1，2，3-三氮唑小分子配体文件通过Chemoffice软件画出2D结构图[8]，再用ChemoBio 3D软件将2D结构转换为3D结构保存下来留作备用。文件格式转换为mol2。最后利用SYBYL软件对小分子配体文件化合物进行优化：①给小分子配体文件加电荷；②对小分子配体文件进行能量优化。接着把所有小分子配体文件保存成配体文件数据库备用。

1.3 受体文件准备

在PDB数据库下载编号为7MLQ的含溴结构域蛋白 4(BDR4)受体文件，再在SYBYL软件中处理受体文件：①先删除受体文件中的水分子；②分析大分子结构；③对受体文件添加氢；④对受体文件添加电荷；⑤提取复合物晶体中的配体小分子。

1.4 分子对接

通过SYBYL软件，将已经处理好的配体文件化合物分子作为配体和7MLQ晶体结构进行分子对接运算。对接设置包括分别以sfxc和Mol2文件格式上传准备好的蛋白质和配体。对接研究使用默认参数运行。

2 结果与讨论

受体与配体活性位点之间的结合亲和力的稳定性用打分函数判定，即分数越高，配体和受体结合也就越稳定。四个天然产物的结构和分子对接打分函数见表1，26个化合物的结构和分子对接打分函数分别见图1和表2。同时也用BET抑制剂iBET-151作为对照，其结构见图2，对接打分函数为6.495 1。结果表明四个天然化学产物中结果都大于6.4，其中花青素得分最高为7.451 4，紫杉醇得分最低为6.440 3。另外在26个化合物中有16个化合物的打分结果大于7，有20个化合物的打分函数高于对照分子，其中化合物8的打分结果最高为8.704 0。

图1 4-甲基-1，2，3-三唑母核结构

图2 抑制剂iBET-151结构

表1 天然产物打分结果

表2 化合结构和对接打分结果

实验结果说明这些化合物与靶点蛋白BRD4有良好的亲和力。该类抑制剂的分子结构主要由4-甲基-1，2，3-三氮唑组成，在1位有一个哌啶环上的取代基，5位有一个吡啶环上的取代基。通过打分函数，发现5位有一个吡啶环上的取代基为芳基取代时最好。

化合8与靶蛋白BDR4的对接结果见图3和图4。从复合物的三维模拟图(见图3)上可以看出氢键主要形成在PRO87、VAL87和CYS136 3个氨基酸残疾上，说明3个氨基酸残基在相互作用中起到了关键性的影响。在二维图(见图3)中可看出，除了3个氨基酸残基参与形成氢键以外，ALA89、TYR98、TYR97和PRO104形成了Pi-Alkyl作用。通过研究其他25个分子的分子对接，也得到了相似的结果(文中未列出)。

图3 化合物8对接三维模拟图

图4 化合物8对接二维模拟图

3 结论

本文选取了4个天然化学产物和已报道的26个合成三氮唑类BET抑制剂为配体分子，将其与BET的BDR4的三维结构(7MLQ)进行了分子对接，并用BET抑制剂iBET-151作为对照。分子对接的结果表明，4个天然化学产物结果都大于6.4，其中花青素得分最高为7.451 4，紫杉醇得分最低为6.440 3。王华等[9]发现花青素是通过抑制分裂素蛋白致活酶的活性从而发挥抗癌作用。目前关于花青素等天然产物的研究不完整，关于它们抗癌作用机制还不明确，需要进一步研究。

26个化合物中16个化合物的打分结果大于7，20个化合物的打分函数高于对照分子，其中化合物8的打分结果最高为8.704 0。三氮唑类5位吡啶环上取代基为芳基取代时，能与周围的氨基酸残基形成稳定的氢键和螯合键。实验结果说明，这26个药物能够较好地抑制BDR4的活性。

BRD4不仅对基因转录的调控至关重要，而且还是基因组稳定性的守护者[10]。由于BET 蛋白的溴结构域在家族成员之间具有约75%的同一性，因此能否实现高选择性化学探针仍不确定。靶向BRD4相互作用蛋白的小分子可能是一种以提高选择性的方式治疗性干扰转录的额外策略。因此，BET抑制剂在治疗癌症方面具有广泛的应用前景。