干扰lncRNA XIST 通过上调miR-429 抑制涎腺腺样囊性癌细胞生长并提高顺铂敏感性

张璇 马里程 孙龙啸 张磊

腺样囊性癌（ACC）又称圆柱瘤或圆柱瘤型腺癌，ACC 占涎腺肿瘤的5%～10%，在涎腺恶性肿瘤中占24%。涎腺ACC（SACC）是生长缓慢但恶性程度高的涎腺上皮性肿瘤，好发于腮腺、颌下腺、舌下腺以及腭腺等小涎腺，具有局部侵袭性强、血行性转移率高、长期预后差等典型生物学特征。铂类药物作为ACC 的一种治疗方法已被广泛探索，但收效甚微。研究表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）-亚依洛尼酰胺异羟肟酸和顺铂（DDP）的联合治疗通过激活细胞衰老来消耗肿瘤干细胞并有效降低ACC 原代细胞的肿瘤活性。有研究表明，沉默长链非编码RNA（lncRNA）X 非活性特异转录本（XIST）抑制非小细胞肺癌的生长并提高DDP 药物的敏感性。lncRNA XIST 参与了胃癌细胞耐药的发生，而其在SACC 中的作用尚未见报道。有研究表明，在多种癌症中miRNA（miR）- 429 表达下调，发挥抑癌作用，但其在ACC 中的作用未见报道。miR-429是参与口腔鳞癌DDP 耐药的关键miRNA。本研究旨在探索干扰lncRNA XIST 是否能通过上调miR-429 来影响SACC 细胞的生长和对DDP 的敏感性。

材料与方法

一、材 料

人SACC 细胞系SACC-83、ACC-2 和正常下颌下腺细胞HSG 均购于中国科学院上海生命科学学院细胞资源中心。1640 培养基、胎牛血清均购于Sigma 公司，TRIzol 购于Ambion 公司，RT 试剂盒购于TaKaRa 公司。Lipofectamine 2000 购于Invitrogen 公司，shRNA-XIST、 shRNA-NC、mimic-NC、miR-429 mimic、 NC inhibitor 和miR-429 inhibitor由广州锐博生物科技有限公司合成。CCK-8 试剂盒、Quick Mutation基因定点突变试剂盒和TUNEL 试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司。双萤光素酶报告基因载体、萤光素酶检测试剂盒均购于Promega 公司。抗体购于Cell Signaling Technology公司。

二、方 法

1. 细胞培养

将人SACC 细胞系SACC-83、ACC-2 和正常下颌下腺细胞HSG 以及DDP 耐药 SACC-83/DDP细胞置于RPMI-1640 培养基中，加入 10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素，放进37 ℃、5% CO饱和湿度的细胞培养箱培养。亲代的SACC-83 细胞持续暴露于DDP 12 个月，通过增加DDP 浓度从 0.5 μg/mL 直至细胞获得10 μg/mL的耐药性。

2. 细胞转染及实验分组

SACC-83 细胞和SACC-83/DDP 细胞中相关质粒根据脂质体2000 转染试剂操作说明进行转染。在探究lncRNA XIST 对细胞生长和药物敏感性的作用时，将两种shRNA-XIST（shRNA-XIST#1：5′-GU GCGUACAGUGCUGUACAGCAU-3′，shRNA-XIST#2：5′-GCTGACTACCTGAGATTTAAG-3′）及其对照shRNA-NC（5′-UACGCUCAGCAUGUGUCACUC-3′）质粒转染进SACC-83 细胞，分别记作SACC-83组、shRNA-NC 组、shRNA-XIST#1 组和shRNA-XIST#2组；将上述干扰效力更显著的组别进行后续实验、记作shRNA-XIST 组，并将shRNA-XIST 质粒转染进SACC-83/DDP 细胞，记作SACC-83/ DDP组、SACC-83/DDP+shRNA-NC组和SACC-83/DDP +shRNA-XIST 组； 将mimic-NC（5′-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3′）和miR-429 mimic（5′-UGCCAA AAUGGUCUGUCAUAAU-3′）转染进SACC-83 细胞，记作mimic-NC 组和miR-429 mimic 组；在探究lncRNA XIST 通过miR-429 对细胞生长和药物敏感性的调节作用时，将shRNA-XIST 和miR-429 inhibitor（5′-ACGGUUUUACCAGACAGUAUUA-3′）及其对照（5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3′）转染进SACC-83 细胞，记作shRNA-XIST+ miR-429 inhibitor 组及shRNA-XIST+NC inhibitor 组。

3. 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测

采用TRIzol 试剂盒提取细胞中总RNA，根据逆转录试剂盒操作说明合成cDNA。在ABI7500 qPCR 系统上根据SYBRGreen 核酸荧光染料进行qPCR 检测，记录Ct 值。采用2法计算目的基因的RNA 水平。每组设3 个复孔，实验独立重复操作3 次。

4. CCK-8 实验

将细胞接种于96 孔细胞培养板中，放进细胞培养箱中培养。根据分组处理细胞后，分别在0、24、48 和72 h 加入CCK-8 溶液10 μL/孔，继续放入培养箱中孵育2 h 后，在酶标仪上设定波长450 nm 检测细胞的吸光值并绘制细胞生长曲线，计算细胞活力=［（OD-OD）/ OD］×100%。每组设3 个复孔，实验独立重复操作3 次。

5.克隆形成试验

在指定条件下处理细胞，并将其接种于12 孔板（100 个细胞/孔），培养2 周后，用0.05%结晶紫（上海碧云天生物技术有限公司）染色细胞集落，并在荧光显微镜下观察并计数。每组设3个复孔，实验独立重复操作3 次。

6. TUNEL 检测

转染48 h 后的细胞，加入50 μL 的TUNEL 反应混合液，在黑暗室温环境放置1 h。用DAB 染色后，再用苏木精复染，冲洗，采用乙醇梯度脱水、二甲苯用来使玻片透明、封片。光学显微镜拍照计数。每组设3 个复孔，实验独立重复操作3 次。

7. 蛋白免疫印迹法检测

收集细胞，用PBS 清洗2 次，采用RIPA 溶液提取细胞中蛋白样品并测定蛋白浓度。用SDSPAGE 分离20 μg 蛋白样品，转移到PVDF 膜上封膜2 h，在4 ℃条件下孵育一抗（1∶1000）过夜。用TBST 洗膜3 次后，二抗（1∶2000）孵育1 h，ECL 发光试剂孵育PVDF 膜10～30 s 后立即放入ECL 成像仪中显色。每组设3 个复孔，实验独立重复操作3 次。

8. 双荧光素酶报告检测

使用脂质体2000 转染试剂将野生型和突变型lncRNA XIST 的荧光素酶表达载体（XIST WT 组和XIST MUT 组）与miR-429 mimic 及mimic-NC 分别转染48 h 后，根据荧光素酶活性检测试剂盒操作说明进行操作，并记录结果。每组设3 个复孔，实验独立重复操作3 次。

三、统计学处理

使用GraphPad Prism 7.0 对所有数据进行统计分析。数据符合正态分布，均以 描述。多组间差异采用单因素和双因素方差分析，采用Turkey进行事后检验。以P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、干扰lncRNA XIST 抑制SACC 细胞增殖并促进其凋亡

RT-qPCR 检测结果显示，lncRNA XIST 在SACC细胞系中表达水平高于HSG 细胞（P ＜ 0.001，P =0.007，图1A），以SACC-83 细胞表达水平最高，选其进行后续实验。与shRNA-NC 对照组相比，shRNA-XIST#1 组和shRNA-XIST#2 组lncRNA XIST 的表达水平降低（P = 0.001，P ＜ 0.001，图1B），通过均值比较发现shRNA-XIST#2 组的抑制效果优于shRNA-XIST#1 组（P = 0.020，图1B），因此选取shRNA-XIST#2 组进行后续实验，并记作shRNA-XIST 组。CCK-8 法检测结果显示相对于shRNA-NC 对照组，shRNA-XIST 组在转染48 h和72 h 后抑制细胞活力（P = 0.020，P ＜ 0.001，图1C）；克隆形成试验结果显示相对于shRNA-NC对照组，shRNA-XIST 组抑制了细胞增殖能力（P ＜0.001，图1D）；TUNEL 检测和蛋白免疫印迹法结果显示相对于shRNA-NC 对照组，shRNA-XIST 组细胞凋亡率增加（P 均＜ 0.001，图1E～H）。以上结果表明，敲降lncRNA XIST 可抑制SACC 细胞增殖并促进其凋亡。

图1 敲降lncRNA XIST 对SACC 细胞增殖和凋亡的作用

二、干扰lncRNA XIST 提高了SACC-83 对DDP的敏感性

RT-qPCR 检测结果显示，相对于SACC-83 组，SACC-83/DDP 组中lncRNA XIST 表达水平升高；相对于SACC-83/DDP+shRNA-NC 组，SACC-83/DDP+shRNA-XIST 组降低了细胞中的lncRNA XIST表达水平（P 均＜ 0.001，图2A）。CCK-8 法检测发现用高于20 μg/mL 的DDP 分别干预SACC-83组和SACC-83/DDP 组细胞后，SACC-83/DDP 组的细胞活力高于SACC-83 组的细胞活力（P ＜ 0.001，图2B）；而相对于SACC-83/DDP+shRNA-NC 组，SACC-83/DDP+shRNA-XIST 组抑制了高于40 μg/mL DDP 干预的细胞活力（P = 0.003，P = 0.008，图2B）。TUNEL 检测和蛋白免疫印迹法结果显示，相对于SACC-83 组，SACC-83/DDP 组细胞凋亡率下降；相对于SACC-83/DDP+shRNA-NC 组，SACC-83/DDP+shRNA-XIST 组促进细胞凋亡（P = 0.002，P ＜ 0.001，图2C～2D）。以上结果说明敲降lncRNA XIST 促进了SACC 细胞对DDP 的敏感性。

图2 敲降lncRNA XIST 对SACC-83 DDP 敏感性的作用

三、 lncRNA XIST 与miR-429 相互作用

通过LncBase Predicted v.2 预测lncRNA XIST和miR-429 的结合位点（图3A）。RT-qPCR 检测结果显示，在SACC-83 细胞中miR-429 表达水平低于HSG 细胞（P 均＜ 0.001，图3B）。相对于mimic-NC 组，miR-429 mimic 组在SACC-83 细胞中miR-429 水平上调（P ＜ 0.001，图3C）。XIST MUT或XIST WT 与miR-429 mimic 或mimic-NC 共转染到细胞中，与mimic-NC+XIST WT 相比，miR-429 mimic +XIST WT 组荧光素酶活性降低，而mimic-NC+XIST MUT 组和miR-429 mimic +XIST MUT 组则无明显差异（P ＜ 0.001，图3D）。并且RT-qPCR结果显示，相对于shRNA-NC 组，shRNA-XIST 组上调了miR-429 表达水平（P ＜ 0.001，图3E）。上述结果表明，在SACC 细胞中lncRNA XIST 靶向负调节miR-429 的表达。

图3 lncRNA XIST 与miR-429 相互作用

四、下调miR-429 表达逆转了shRNA-XIST对SACC 细胞增殖的抑制作用

在SACC-83 细胞转染miR-429 inhibitor，相对于NC inhibitor组成功敲降miR-429的表达（P ＜ 0.001，图4A）。通过CCK-8 法和克隆形成试验检测发现，相对于shRNA-XIST+NC inhibitor 组， shRNAXIST+miR-429 inhibitor 组细胞活力在72 h 增加，增殖能力上升（P = 0.02，P ＜ 0.05，图4B～4C）。TUNEL 检测结果显示，相对于shRNA-XIST+NC inhibitor 组，shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 组细胞凋亡率下降（P ＜ 0.001，图4D）。蛋白免疫印迹法结果显示，相对于shRNA-XIST+NC inhibitor 组，shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 组抗凋亡蛋白水平上升，促凋亡蛋白水平下降（P 均＜ 0.001，图4E）。以上结果表明敲降miR-429 表达可以逆转shRNAXIST 对SACC 细胞增殖的抑制作用。

图4 shRNA-XIST 通过miR-429 对SACC 细胞增殖和凋亡的作用

五、下调miR-429 表达逆转了shRNA-XIST对SACC 细胞DDP 敏感性

CCK-8 法检测结果显示，在用高于40 μg/mL的DDP处理细胞时，相对于SACC-83/DDP+shRNAXIST+NC inhibitor组，SACC-83/DDP+shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 组促进了细胞活力（P = 0.004，图5A）。TUNEL 检测结果显示，相对于SACC-83/DDP+shRNA-XIST+NC inhibitor 组，SACC-83/DDP+shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 组抑制了细胞凋亡水平（P = 0.008，图5B～5C）。蛋白免疫印迹法结果显示，相对于SACC-83/DDP+shRNA-XIST+NC inhibitor 组，SACC-83/DDP+shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 组抗凋亡蛋白水平上升，促凋亡蛋白水平下降（P = 0.002，P = 0.029，P ＜ 0.001，图5D）。以上结果表明敲降miR-429 表达可以逆转shRNAXIST 对SACC 细胞的耐药作用。

图5 shRNA-XIST 通过miR-429 对SACC 细胞DPP 敏感性的作用

讨 论

ACC 是一种发生在分泌腺内的恶性肿瘤，最常见于头颈部的唾液腺。SACC 起源于导管、肌上皮、基底细胞，约占主要唾液腺恶性肿瘤的25%，约50%位于小腺体，是一种特殊的恶性肿瘤以其缓慢但渗透式的增长而闻名，没有明显的边界。lncRNA 和microRNA 在各种恶性肿瘤的发生发展过程中均发挥着复杂而广泛的作用，包括影响肿瘤细胞的增殖、转移、凋亡及药物敏感性。本研究发现lncRNA XIST 在SACC 细胞中表达水平上调，影响肿瘤细胞的生长和对DDP 的耐药性。

XIST 是一种由XIST 基因编码的lncRNA，在哺乳动物中负责X 染色体失活。lncRNA XIST 参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移以及对化学治疗和放射治疗的抵抗，如胃癌、膀胱癌和甲状腺癌等。同时沉默lncRNA XIST 抑制非小细胞肺癌和胃癌的生长并促进对DDP 的敏感性。而本研究发现，在SACC 细胞系中，敲降lncRNA XIST 表达可以抑制细胞活力、克隆形成并促进细胞凋亡，同时提高了细胞对DDP 的敏感性。

lncRNA XIST 被证明可以调节多种miRNA，如miR144-3p、miR-137、miR-367、let-7 和miR-92b，从而调节Notch-1、PXN、ZEB2、BAG-1、Smad7 等多种基因的表达。通过LncBase Predicted v.2 预测lncRNA XIST 能够和miR-429 结合。有研究表明，miR-429 在多种癌症中发挥抑癌作用，但在ACC中的作用尚未见报道。miR-429 在口腔鳞癌DDP耐药中发挥重要的作用。本研究发现miR-429 在SACC 细胞中表达下调，且能够被lncRNA XIST 靶向负调控，进一步研究发现lncRNA XIST 可通过靶向miR-429 参与SACC 细胞的生长并影响DDP药物敏感性。

综上所述，本研究表明lncRNA XIST 在SACC细胞增殖、凋亡和药物敏感性中起重要作用，为治疗SACC 提供了诊断和治疗的潜在靶点。