4种杂粮对大鼠肠道菌群组成及短链脂肪酸的影响

韩 飞，韩阳阳,，赵建新，王 勇，綦文涛

（1.国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

《中国居民膳食指南》（2016版）要求成年人每天摄入谷薯类食物250～400 g，其中全谷物和杂豆类50～150 g。谷物尤其是全谷物在膳食中的重要性得到越来越广泛的关注。尽管目前已知全谷物富含碳水化合物、蛋白质、膳食纤维、多种矿物质和维生素以及植物化合物等多种营养素，但是全谷物不是这些营养素的简单混合，而是作为一个有机整体发挥着健康作用。同时，越来越多的研究表明，膳食是影响肠道菌群结构和功能最为重要且较为迅速的因素，膳食导致的肠道菌群变化在代谢综合征发生发展中起着重要作用。微生态学和营养学研究也发现，肠道菌群的结构失调是许多慢性疾病（如肥胖、糖尿病、高血压、冠心病、心脑血管疾病和结肠癌等代谢性疾病）的直接诱因。膳食中全谷物对肠道菌群的积极影响也有研究报道，大多集中于全谷物中的膳食纤维和酚类物质对肠道益生菌增殖的促进作用或对肠道病原菌增殖的抑制作用、增加短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）的含量以及SCFAs作为信号分子参与宿主代谢通路从而调节宿主生理状态等。但是，将熟制全谷物作为整体（替换大鼠50%日粮），集中探讨其对机体不同肠段微生物和SCFAs影响的研究鲜见报道。因此，本实验以经熟制后的燕麦、甜荞、糜米和谷米4种我国膳食中最常见的杂粮作为整体替换大鼠50%日粮，研究杂粮对大鼠回肠、盲肠和结肠微生物和SCFAs的影响，为杂粮在膳食中的广泛应用及开发相关杂粮食品提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级7 周龄健康雄性SD大鼠50 只，体质量（302.10±9.58）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2021-0006。

裸燕麦（‘坝莜一号’）、甜荞（‘西农9976’）、糜米（‘榆糜2号’）和谷米（‘峰红谷’）均由西北农林科技大学提供。将杂粮样品用2 倍质量的纯净水浸泡2 h，用电饭煲杂粮档焖熟，冷却后用冷冻干燥机干燥，低温粉粹机粉碎，过60 目筛，-20 ℃储藏备用。

乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸等标准品、耐热-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、基因组DNA提取试剂盒 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；盐酸、氢氧化钠、浓硫酸、偏磷酸、石油醚、丙酮、乙酸、乙酸乙酯国药集团化学试剂有限公司；抗性淀粉试剂盒 爱尔兰Megazyme公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PHSJ-5型精密pH计 上海精密科学仪器公司；3K 15型高速冷冻离心机 德国西格玛公司；MB-WFS4029型电饭煲 美的公司；FD-2型真空冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司； 2300型凯式定氮仪、Fibertec 8000纤维分析仪 瑞典FOSS公司；SpectraMax Plus 384酶标仪 美国Molecular Devices公司；电泳仪北京六一生物科技有限公司；ABI 9700型荧光定量仪上海赛默科技生物发展有限公司；7890B型气相色谱仪美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 动物实验设计与饲养

预饲一周后将大鼠按照随机分组方法分成5 组，每组10 只，即对照组（basal diet group，BDG）（饲喂基础日粮）、燕麦组（oat group，OG）（饲喂50%燕麦+50%基础日粮）、甜荞组（buckwheat group，BG）（饲喂50%甜荞+50%基础日粮）、糜米组（proso millet group，PG）（饲喂50%糜米+50%基础日粮）和谷米组（millet group，MG）（饲喂50%谷米+50%基础日粮），配方及能量见表1。实验周期为6 周，大鼠同室分笼饲养，每笼1 只，饲养于SPF级动物房，自由饮水采食，昼夜交替12 h，温度控制在（23±2）℃，相对湿度60%。6 周后处死大鼠，取样。

表1 不同谷物日粮的配方及能量Table 1 Formulation and energy levels of different diets

1.3.2 样品采集和检测

1.3.2.1 常规指标的测定

水分质量分数的测定：GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》；灰分质量分数的测定：GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》；蛋白质质量分数的测定：GB 5009.5—2010《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》；脂肪质量分数的测定：GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》；粗纤维质量分数的测定：GB/T 5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》。抗性淀粉质量分数采用Megazyme抗性淀粉测定试剂盒测定；非淀粉多糖质量分数的测定参考龚敏和黄庆华等的方法进行测定。

1.3.2.2 大鼠体质量、采食量、食物利用率和粪便含水率的测定

实验期间，每周测定大鼠体质量和采食量。称体质量前，大鼠禁食12 h。计算实验期间日粮消耗量和大鼠体质量增量，根据公式（1）计算每组大鼠的食物利用率。实验期结束收集大鼠粪便，记录大鼠粪便的湿质量，并将粪便置于105 ℃烘箱烘干至恒质量，记录大鼠粪便的干质量，根据公式（2）计算每组大鼠粪便含水率。

1.3.2.3 大鼠盲肠和结肠质量测定

解剖大鼠，取出整个消化道，除去肠系膜，分别测定含有内容物时盲肠、结肠的质量，然后称量去除内容物后的盲肠和结肠的质量。

1.3.2.4 肠道内容物pH值的测定

将盲肠和结肠内容物从-80 ℃冰箱取出，置于冰水浴中解冻后，称取相应的样品1 g左右，以1∶20（/）的比例加入蒸馏水，充分搅拌均匀后静置0.5 h，然后取上清液用精密pH计进行测定。

1.3.2.5 肠道内容物中SCFAs的测定

气相色谱法测定盲肠和结肠内容物中的SCFAs，参考Zhao Guohua等方法。0.5 g冷冻盲肠和结肠内容物用1 mL生理盐水稀释，将内容物涡旋混合并以10 000 r/min离心5 min，收集上清液，以体积比9∶1加入25 g/100 mL的偏磷酸溶液。将混合物在4 ℃下培养过夜，然后以10 000 r/min离心5 min，取上清液测定。气相色谱法定量分析SCFAs，采用DB-FFAP色谱毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.50 μm），具体设定为初始温度80 ℃、0.5 min，以5 ℃/min的速率加热至130 ℃，保持2 min，并以20 ℃/min的速率加热至240 ℃，保持1 min。氢火焰离子化检测器在270 ℃下检测信号。以乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸为标准品，内标物为2-乙基丁酸。

根据标准品色谱图中SCFAs浓度计算峰面积，以获得每个SCFA的校准图。对校准图中的数据点进行回归分析，得出目标SCFA的斜率、截距和决定系数。用等体积肠道内容物上清液稀释系列标准溶液制备的系列溶液测试肠道内容物样品的线性响应。用相对响应系数（relative response factor，RRF）对峰面积进行定量。RRF计算如公式（3）所示。

式中：为1.0 mmol/L SCFAs的峰面积；为内标物的峰面积。

根据RRF、内标物浓度/（mmol/L）、SCFAs峰面积（）和内标物峰面积（）计算SCFAs浓度/（mmol/L），如公式（4）所示。

1.3.2.6 大鼠肠道菌群的测定

大鼠回肠、盲肠和结肠内容物采集后立即置于液氮中，放在-80 ℃下保存待测。

细菌基因组的提取，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增、定量和测序：用十六烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠法从回肠、盲肠和结肠内容物中提取总基因组DNA。使用正向引物5’-CCTACGGGAGGAGAG-3’和反向引物5’-ATTACCGGCTGCTGG-3’从微生物基因组DNA中PCR扩增16S rRNA的V3区。将含有荧光染料的加载缓冲液与PCR产物混合，并在2%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。选择主谱带在400～450 bp之间的样品进行进一步实验。对不同样品PCR之后的产物进行等质量浓度比混合，并用Gene JET Gel Extraction Kit试剂盒纯化。利用NEB Next. Ultra试剂盒建立序列文库，用Qubit2.0荧光定量仪和Bioanalyzer 2100生物分析仪对RNA完整性及质量进行评估。文库在Illumina MiSeq平台上进行测序，250 bp/300 bp配对末端读数。

生物信息学分析：使用FLASH合并来自原始DNA片段的成对末端读取，当一些读取与来自相同DNA片段的相反末端的读取重叠时，FLASH被设计为合并成对末端读取；序列分析采用QIIME1.8.0软件包（http://qiime.Org）；采用Metastats软件证实两组个体分类丰度的差异；线性判别分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）用于不同组内生物标志物的定量分析；基于Bray-Curtis相异距离矩阵进行了方差分析确定两组之间微生物群落的差异。

1.4 数据统计与分析

数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析和Tukey事后测试差异分析，＜0.05表示有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 实验日粮常规营养指标的分析

谷物杂粮作为一个整体50%替代基础日粮后形成的4 组实验日粮的常规营养指标见表2。4 组实验日粮的各项营养指标均存在一定的差异，因此，在分析其对大鼠肠道菌群及各项生理指标的影响时，应将杂粮视作一个整体，而非仅关注某些成分。

表2 不同谷物日粮的营养成分Table 2 Nutritional components of different diets

2.2 摄入不同谷物日粮对大鼠体质量增加、采食量和食物利用率的影响

由表3可知，饲喂6 周后，4个谷物杂粮组大鼠的饲料采食量和体质量增量都显著高于BDG（＜0.05），但食物利用率间没有显著性差异，说明4个谷物杂粮组都能促进大鼠采食。

表3 饲喂6 周后不同谷物日粮对大鼠体增质量、采食量及食物利用率的影响Table 3 Effects of experimental diets on body mass gain, feed intake,and feed utilization efficiency of rats after six weeks of feeding

2.3 摄入不同谷物日粮对大鼠粪便含水率的影响

饲喂6 周后，不同实验组大鼠粪便的湿质量、干质量和含水率见表4。粪便含水量低可能引起便秘。实验结果表明，4个杂粮组大鼠粪便的含水率均高于BDG，且OG和BG大鼠粪便的湿质量、干质量都显著高于BDG（＜0.05）。在4种实验日粮中，OG和BG粪便含水率（24.64%和25.76%）是BDG（12.06%）大鼠粪便含水率的2 倍多。

表4 不同谷物日粮对大鼠粪便湿质量、干质量及粪便含水率的影响Table 4 Effects of experimental diets on wet and dry mass of feces and water content in feces

2.4 摄入不同谷物日粮对大鼠盲肠、结肠质量和内容物pH值的影响

从表5可见，含有内容物的盲肠质量几乎是含有内容物结肠质量的2 倍，说明大鼠有非常发达的盲肠；去除内容物后，OG和BG大鼠盲肠壁质量显著高于其他组（＜0.05），而结肠壁没有观察到类似的结果。结肠内容物的pH值均低于盲肠内容物的pH值，说明大鼠虽然有发达的盲肠，但是微生物发酵产生SCFAs的肠段主要在结肠而不是盲肠。此外，饲喂4种谷物大鼠盲肠和结肠内容物的pH值均显著低于BDG（＜0.05），且BG无论是盲肠还是结肠，其内容物的pH值都最低，分别是6.21和6.01，说明甜荞比起其他几种谷物杂粮更有利于微生物发酵。

表5 不同谷物日粮对大鼠盲肠和结肠质量及盲肠和结肠内容物pH值的影响Table 5 Effects of experimental diets on cecum and colon mass and pH of cecum and colonic contents of rats

2.5 摄入不同谷物日粮对大鼠盲肠和结肠内容物中SCFAs的影响

从表6可见，结肠内容物的SCFAs含量远高于盲肠内容物的SCFAs，这与表5中结肠的pH值低于盲肠的pH值结果是一致的，说明结肠是微生物发酵的主要肠段。4种谷物杂粮组大鼠盲肠内容物总SCFAs浓度均显著高于BDG（＜0.05），且BG和MG的SCFAs总量最高（37.89 µmol/g和36.95 µmol/g）几乎都是BDG（14.99 µmol/g）的2.5 倍，同时，BG的SCFAs中以乙酸和丁酸为主，而其余3种谷物杂粮和BDG的SCFAs中以乙酸和丙酸为主。同时，4种谷物杂粮组大鼠结肠内容物总SCFAs浓度均高于BDG，且BG和MG显著高于BDG（＜0.05），BG的SCFAs总量最高（153.46 µmol/g），是BDG（46.15 µmol/g）的3.3 倍。

表6 不同谷物日粮对大鼠盲肠和结肠SCFAs含量的影响Table 6 Effects of experimental diets on SCFA levels in cecal and colonic contents of rats

在总SCFAs中，乙酸的含量最高，几乎占总SCFAs 75%以上，有的组高达96%，乙酸是细菌向宿主提供能量的主要来源。其次是丙酸和丁酸，异丁酸含量最低。

2.6 摄入不同谷物日粮对大鼠回肠、盲肠和结肠内容物中菌群在门和属水平的影响

使用16S rRNA基因测序研究了4种谷类杂粮对回肠、盲肠和结肠消化道的影响。图1显示了在门水平上各组肠道微生物群组成的详细信息。回肠中的优势菌门包括厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria），在所有实验组中均无明显差异（图1A）。厚壁菌门占所有实验组细菌总序列的89%以上。在盲肠和结肠内容物中，优势菌门为厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和软壁菌门（Tenericutes）（图1B、C）。厚壁菌门也是盲肠和结肠中最丰富的门，其占细菌总序列的70%以上。盲肠内容物中，BG的厚壁菌门相对丰度最高（83%），MG最低（69%）；疣状菌门的相对丰度BDG最高（18%），PG最低（5%）；对于拟杆菌门，MG的相对丰度最高（12%），OG和BG较低（3%和4%）。结肠内容物中，除MG（73%）外，所有实验组的厚壁菌门相对丰度均大于82%；疣微菌门的相对丰度，BDG最高（12%），BG最低（4%）；对于拟杆菌门，MG的相对丰度最高（15%），OG最低（5%）。

图1 不同谷物日粮对大鼠回肠（A）、盲肠（B）和结肠（C）内容物中门水平微生物群相对丰度的影响（n＝5）Fig. 1 Effects of experimental diets on relative abundance of microbiota at the phylum level in ileal (A), cecal (B), and colonic (C)contents of rats (n = 5)

大鼠饲喂6 周后，其回肠、盲肠和结肠内容物中厚壁菌门与拟杆菌门的比值见表7，回肠内容物厚壁菌门与拟杆菌门的比值高于盲肠和结肠。回肠内容物中，MG厚壁菌门与拟杆菌门的比值最高，为304.5，PG最低，为75.6，且除MG外，PG、OG和BG回肠内容物厚壁菌门与拟杆菌门的比率分别比BDG低66.2%、47.7%和39.2%；盲肠内容物中，4种谷物杂粮组厚壁菌门和拟杆菌门的比值均低于BDG；结肠内容物中，OG厚壁菌门和拟杆菌门的比值最高，为20.8，BG最低，为11.4。同时发现，BG大鼠回肠、盲肠和结肠内容物厚壁菌门和拟杆菌门的比值分别比对照组低39.2%、38.8%和24.5%。

表7 不同谷物日粮对大鼠回肠、盲肠、结肠内容物厚壁菌门和拟杆菌门比值的影响Table 7 Effects of experimental diets on the ratio of Firmicutes to Bacteroidetes in ileum, cecal, and colonic contents of rats

人体实验研究发现，肥胖个体中厚壁菌门和拟杆菌门比例较高，在能量限制的条件下，体质量减轻与厚壁菌门和拟杆菌门比例降低有关。有研究显示在肥胖模型中，厚壁菌门和拟杆菌门的比例可能与肠道微生物的代谢潜力相关，可能增加微生物从膳食中获取能量的能力，拟杆菌门丰度增加或厚壁菌门丰度降低都有利于控制肥胖。本实验结果显示，在回肠和盲肠内容物中PG厚壁菌门和拟杆菌门的比例最低，结肠内容物中BG厚壁菌门和拟杆菌门的比值最低，可见全谷物可以调节肠道菌群的组成，肠道菌群的组成与体质量的控制有重要联系。说明甜荞和糜米有通过调节肠道微生物菌群的结构从而改善肠道健康的潜力。

大鼠饲喂6 周后，其回肠、盲肠和结肠内容物菌群在属水平上的相对丰度比较如图2所示。回肠中丰度最高的3个菌属依次是、和（图2A）。相对丰度以OG最高（40%），BDG最低（10%）。相对丰度以PG最高（12%）；盲肠中相对丰度较高的菌属依次是、、和（图2B）。其中，相对丰度最高的是BDG（14%），最低的是PG（5%）。对于，PG相对丰度最高（13%），OG和BG相对丰度较低（均小于5%）。对于，OG相对丰度最高（4%）；结肠中相对丰度较高的菌属依次是、、和（图2C）。在PG中相对丰度最高（37%），其次为BG（20%），BDG相对丰度最低（5%）。在BG中相对丰度最低（5%）。在BG中相对丰度较高（4%）。

图2 不同谷物日粮对大鼠回肠（A）、盲肠（B）和结肠（C）内容物中属水平微生物群相对丰度的影响（n＝5）Fig. 2 Effects of experimental diets on relative abundance of microbiota at the genus level in ileal (A), cecal (B), and colonic (C)contents of rats (n = 5)

3 讨 论

当前，我国居民膳食中主食摄入的问题主要集中在以下3个方面：一是主食摄入过精过细，全谷物摄入不足；二是主食摄入结构单一，主要摄入大米和小麦粉，杂粮杂豆和薯类的摄入不足；三是口粮摄入总量不足。结构单一且精细加工的谷物过量摄入会增加各种慢性疾病的患病风险，如肥胖、2型糖尿病、肠癌等。近年的大量研究表明，全谷物和杂粮的摄入对营养相关慢性疾病的预防有积极的作用，但是大部分研究集中于全谷物或杂粮的某一成分的研究。本研究将谷物杂粮作为一个整体替代50%的日粮，探究其对大鼠消化道菌群和SCFAs含量的影响。

从实验结果可以看出，4种杂粮组大鼠粪便的含水率均高于BDG，且BG和OG大鼠粪便含水率均是BDG的2 倍。便秘是当今社会人群面对的顽疾之一，增加粪便的含水量可有效减轻便秘的症状。由表2可知，4种谷物杂粮富含不消化碳水化合物，如抗性淀粉、非淀粉多糖、阿拉伯木聚糖等，这些碳水化合物可逃避小肠消化，到达盲肠和结肠发酵，调节肠道微生物结构和组成。同时，SCFAs能降低消化道pH值。从表6可见，4种杂粮组大鼠盲肠和结肠的SCFAs都显著高于BDG（＜0.05），其中BG的SCFAs最高，是BDG的3.3 倍；同时，4种杂粮组大鼠盲肠和结肠的pH值也均显著低于BDG（＜0.05），同样的BG的pH值在盲肠和结肠中也都是最低的，这与王勇等的研究结果略有不同，其研究中燕麦组SCFAs总量高于甜荞组，可能的原因之一是，本实验采用的是甜荞，而王勇等研究原料采用的是苦荞，且本实验甜荞的替代比例是50%，而王勇等的实验苦荞的替代比例是20%。一项对谷物蛋白质评价的研究也发现，甜荞的蛋白品质评分高于燕麦，且三者的评分顺序是甜荞＞苦荞＞燕麦。同时，以往的研究表明，SCFAs可调节宿主的生物反应，包括肠道完整性、脂质代谢和免疫系统。丁酸盐是结肠上皮细胞的主要能量来源，可降低肠道黏膜通透性，促进肠道屏障恢复，预防或降低结肠癌的发病率，丙酸对代谢健康有积极作用，如降低血清胆固醇含量。本研究表明，BG盲肠和结肠消化道中的SCFAs总含量最高，可见甜荞调节肠道健康作用非常显著。

研究表明，当抗性淀粉和非淀粉多糖存在于谷物基质中时，通常与人类肠道微生物群产生的高产量SCFAs有关。在结肠中形成的SCFAs数量和类型可受微生物群组成、膳食纤维利用率及其理化性质等的影响。乳酸杆菌（）主要产生乳酸，粪杆菌（）主要产生丁酸和乙酸，阿克曼氏菌（）主要产生丙酸。虽然抗性淀粉主要作用于盲肠，但在结肠中存在抗性淀粉的情况下，微生物群对非淀粉多糖的利用率较低。由表2可知，BG的抗性淀粉含量最高，这可能是BG盲肠和结肠SCFAs最高的原因之一；OG肠道中的高SCFAs含量可能与丰富的膳食纤维、非淀粉多糖和阿拉伯木聚糖有关。

肠道微生物通过发酵产生SCFAs，进而调节机体的能量代谢、免疫和肠道发育等。由于没有任何一属细菌能水解所有的营养底物，且没有任何一属细菌发酵碳水化合物都能产生乙酸、丙酸和丁酸这3种SCFAs,肠道的SCFAs类型和分布反映了不同微生物类型的代谢协作。肥胖人群中厚壁菌门与拟杆菌门的比例相对高于健康人群。抗性淀粉增加了人体中放线杆菌和拟杆菌的数量，减少了厚壁菌的数量。本研究发现，大鼠回肠、盲肠和结肠内容物中均以厚壁菌门为主，盲肠内容物中，4种杂粮组厚壁菌门和拟杆菌门的比值均低于BDG，PG回肠和盲肠消化道中厚壁菌门与拟杆菌门的比值最低，BG结肠消化道壁厚壁菌门与拟杆菌门的比值最低，且BG大鼠回肠、盲肠和结肠内容物厚壁菌门和拟杆菌门的比值分别比BDG低39.2%、38.8%和24.5%，说明4种杂粮均有利于大鼠盲肠和结肠中拟杆菌门的增殖，且甜荞和糜米的这一作用表现突出。在本研究中，在摄食甜荞和糜米饮食的大鼠中观察到厚壁菌门和拟杆菌门比值下降，这一发现与Parnell等关于益生元的研究结果一致。甜荞组饮食中含有最高的抗性淀粉，这可能部分导致结肠消化道中的厚壁菌门和拟杆菌门比值最低的结果。

4 结 论

本实验研究了分别以甜荞、燕麦、糜米、谷米替代50%大鼠基础日粮，饲喂6 周后，大鼠肠道菌群变化和SCFAs的影响。主要实验结论如下：1）4种谷物杂粮都可以增加大鼠粪便的含水率，BG和OG大鼠粪便含水率是BDG的2 倍，说明甜荞和燕麦有改善便秘的的潜力；2）4种谷物杂粮都显著增加了大鼠盲肠和结肠SCFAs的含量（＜0.05），同时相应地降低了盲肠和结肠的pH值，且BG的SCFAs含量最高，是BDG的3.3 倍，说明甜荞有明显调节肠道健康的潜力；3）大鼠回肠、盲肠和结肠内容物中以厚壁菌门为主。PG回肠和盲肠消化道中厚壁菌门与拟杆菌门的比值最低，BG结肠消化道壁厚壁菌门与拟杆菌门的比值最低，说明甜荞和糜米有通过调节肠道菌群开发成为减肥食品的潜力。综上，谷物杂粮对大鼠肠道内容物的pH值、SCFAs含量和菌群组成都有重要的调节作用，且甜荞调节作用尤其显著，在日常膳食中应保证适量谷物杂粮的摄入。