草鱼鳞胶原蛋白肽对骨质疏松小鼠骨微结构、血清TNF-α、IL-1β与IL-6和肠道菌群的影响

杨 平，王丽娟，徐 昕，徐彩红，公丽艳，黄 趁，许 青,*

（1.沈阳师范大学学前与初等教育学院，辽宁 沈阳 110034；2.沈阳师范大学粮食学院，辽宁 沈阳 110034）

骨质疏松（osteoporosis，OP）是一类以骨量减少和骨微结构破坏为特点，严重威胁中老年人健康的骨代谢性疾病。我国老年居民OP患病率增长迅速，50 岁以上人群OP患病率达19.2%，65 岁以上人群患病率达32.0%。OP是一种整合协同信号通路和细胞因子的系统性疾病，炎性因子在OP发病中起重要作用。血清炎性细胞因子中的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6等可以促进破骨细胞吸收骨、抑制成骨细胞形成骨，导致骨密度下降，特别是TNF-α作为前炎性因子之一，可以始动调节很多炎性因子的释放，触发骨的吸收。此外，OP还与肠道菌群有关，平衡的肠道菌群有利于维持骨代谢健康。研究发现，肠道菌群可以影响骨的积累和丢失，并可以与免疫系统共同影响卵巢切除C57BL/6小鼠的骨微结构。因此，通过营养干预炎性细胞因子的分泌，调控肠道菌群，成为了目前防治OP症的新策略。

胶原蛋白肽（collagen peptide，CP）是胶原蛋白的酶解产物，可以促进人体成骨细胞增殖，抑制破骨细胞活性，平衡骨转换的能力，预防与年龄相关的骨质流失，而且可以调节肠道菌群，改变小鼠肠道微生物多样性和粪便菌群组成。但是，目前对CP调节肠道菌群与预防OP的机制仍不清楚。

本研究通过切除小鼠卵巢建立OP模型，测定草鱼鳞CP对小鼠股骨生物力学、骨微结构、血清炎性细胞因子、肠道菌群相关指标的影响，分析OP调节过程中CP与血清中TNF-α、IL-1β、IL-6质量浓度以及肠道菌群之间的关系，研究CP辅助治疗OP的效果及其作用机制，期望为以CP作为营养补充剂辅助治疗OP提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级6 月龄雌性ICR小鼠40 只，体质量（18±2）g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001，每笼5 只，喂食普通颗粒饲料，室温（20±2）℃，相对湿度40%～65%，自然光照，保持良好通风，自由摄取水和食物。

草鱼鳞购自沈阳大润发超市。

复合蛋白酶（1.5 AU/g）、风味蛋白酶（500 LAPU/g）丹麦Novozymes公司；钙尔奇D 惠氏制药有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

MN002型Micro CT扫描仪 德国布鲁克公司；X-12R型高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；Scientz-12N型冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；MultiskanFC型多功能酶标仪 美国赛默飞世尔公司。

1.3 方法

1.3.1 CP的制备

根据本课题组的前期研究工作，以草鱼鳞为原料，选用复合蛋白酶与风味蛋白酶同步双酶解，在酶质量比6∶4、鱼鳞质量浓度18.75 g/L、酶解温度51.5 ℃、pH 7的条件下酶解3 h，经中空纤维膜（3 kD）过滤，得到CP溶液，冻干后保存备用。

1.3.2 动物分组及造模

将小鼠按体质量随机分为假手术组（C组）、模型组(M组)、钙尔奇D组（Ca组）、草鱼鳞胶原蛋白组（PCa组），每组10 只。除C组外的各组小鼠经10 g/L戊巴比妥钠麻醉后，取背侧正中切口进入腹腔，摘除双侧卵巢；C组术式同上，但不切除卵巢，仅切除卵巢大小的脂肪组织，术后恢复7 d后进行正式实验。Ca组灌胃钙尔奇D（260 mg/kg·d），PCa组灌胃CP（750 mg/kg·d）和钙尔奇D（260 mg/kg·d），C组和M组灌胃1 mL的质量浓度9 g/L氯化钠溶液，每只小鼠灌胃1 次/d。连续喂养28 d后，无菌环境下取小鼠肠道粪便于灭菌EP管中，液氮冻存。粪便取样完毕24 h后，取心脏内血液和股骨备用。

1.3.3 股骨生物力学特性测定

采用三点弯曲法测定股骨生物力学特性。将离体的右侧股骨置于10 mm跨距支架上，设置股骨中段为加载点，以1 mm/min加载速率匀速垂直向下挤压至股骨断裂，记录最大弯曲荷载和最大弯曲应力。

1.3.4 股骨微结构分析

采用Micro CT扫描分析股骨微结构。质量浓度40 g/L多聚甲醛溶液固定小鼠左侧股骨24 h后，设定扫描条件为50 kV电压、800 µA电流、15 μm分辨率，沿股骨长轴扫描，选取距离股骨远端生长板1.0 mm的骨组织为松质骨感兴趣区（region of interest，ROI），提取图像信息，进行三维重组，以中心直径为4 mm的圆柱体作为感兴趣区，采用系统自带的分析软件对获取图像进行定量分析，主要包括骨微观结构参数中骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁空隙（trabecular separation，Tb.Sp）、结构模式指数（structural model index，SMI）。

1.3.5 血清炎性细胞因子检测

小鼠血清炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的质量浓度检测采取酶联免疫吸附试验方法，按照试剂盒说明书进行测定。

1.3.6 肠道菌群多样性分析

干冰运输小鼠粪便至上海派森诺生物医药科技有限公司，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增16S rRNA基因中的V3～V4区域，QIIME2平台分析小鼠肠道菌群结构微生物组数据。获得每个操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）代表序列的分类学信息，分析Alpha多样性、Beta多样性、分类学组成，鉴定组间差异物种。

1.4 数据处理与分析

实验数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，＜0.05为差异显著，有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 草鱼鳞CP对小鼠股骨生物力学特性的影响

由图1可知，M组的最大弯曲荷载和最大弯曲应力分别为（159.3±12.1）MPa和（18.41±1.96）N，C组最大弯曲荷载和最大弯曲应力分别为（201.2±18.7）MPa和（27.75±2.02）N，M组极显著低于C组（＜0.01），表明卵巢切除使小鼠股骨生物力学参数下降，抗弯曲能力和抗外压能力减弱；与M组比，PCa组最大弯曲荷载和最大弯曲应力分别为（178.2±13.3）MPa和（22.18±1.01）N，显著升高（＜0.05），Ca组分别为（168.14±11.80）MPa和（19.13±2.01）N，升高不显著（＞0.05）。可见，补充CP可以提高OP小鼠股骨的抗弯曲能力和抗外压能力，增强股骨生物力学特性。

图1 小鼠股骨最大弯曲荷载和最大弯曲应力值Fig. 1 Maximum bending load and maximum bending stress of mouse femur

2.2 草鱼鳞CP对小鼠股骨微结构的影响

骨微观结构参数中BV/TV代表骨小梁的骨量，Tb.Th代表骨小梁平均厚度，Tb.N代表骨组织与非骨组织交点数量的平均值，Tb.Sp代表骨小梁之间的髓腔平均宽度，SMI代表描述小梁中板层结构和杆状结构比例，发生OP后Tb.N和Tb.Th均减少，Tb.Sp和SMI均增加。由表1可见，与C组比，M组的BV/TV、Tb.N、Tb.Th指标显著下降（＜0.05），Tb.Sp、SMI显著提高（＜0.05），表明切除卵巢使小鼠骨小梁数量减少、厚度降低，骨板层结构减少，骨分解大于合成。与M组比较，PCa组中BV/TV、Tb.Th、Tb.N显著升高（＜0.05），Tb.Sp、SMI显著下降（＜0.05），Ca组中BV/TV、Tb.Th显著升高（＜0.05），Tb.Sp显著下降（＜0.05），Tb.N、SMI没有显著变化（＞0.05），这表明补充CP和钙尔奇D后股骨骨小梁数量增多、厚度增加，板层结构增多，骨合成大于分解，且PCa组作用效果优于Ca组。

表1 小鼠股骨的微观结构参数Table 1 Microstructure parameters of femoral trabecula in mice

由图2可见，股骨Micro CT的ROI区三维重建图像中M组和Ca组微观结构表现相似，骨小梁数量较少，间距增大，连接性差，骨微结构被破坏。PCa组骨小梁数量较多、较厚间距较小，连接性及完整性较好，未见断裂现象，与C组图像相似，表明补充CP后小鼠骨量增加，骨微结构得到修复。

图2 小鼠股骨小梁的三维结构重建Fig. 2 Three-dimensional reconstructed structure of femoral trabecula in mice

2.3 草鱼鳞CP对小鼠血清炎性细胞因子质量浓度的影响

炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α可刺激破骨细胞的生成和融合，增加骨髓库中破骨细胞前体细胞的比例及促进破骨细胞的分化，使骨吸收增加，骨重建失去平衡，骨量下降。其中，TNF-α是引起OP发生的核心，是炎性细胞因子水平升高的始动因素。研究发现，TNF-α单克隆抗体可有效预防或逆转OP，敲除TNF-α编码基因的去势小鼠不再出现OP，而敲除IL-6、IL-1编码基因的小鼠仍会发生OP。表2显示，与C组相比，M组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α质量浓度显著升高（＜0.05），表明卵巢切除引起了小鼠血清炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌增加，使骨吸收大于形成。与M组相比，PCa组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α质量浓度显著降低（＜0.05），而Ca组IL-1β、IL-6质量浓度显著降低（＜0.05），TNF-α质量浓度无显著改变（＞0.05），可见钙尔奇D对OP小鼠血清中TNF-α质量浓度没有显著影响，而补充CP能够显著降低TNF-α的质量浓度。因此，CP可以通过降低TNF-α分泌，抑制破骨细胞生成，促进骨形成，平衡骨转换的能力，PCa组作用强于Ca组。

表2 小鼠血清炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的质量浓度Table 2 Concentrations of serum IL-1β, IL-6 and TNF-α in mice

2.4 草鱼鳞CP对小鼠肠道菌群结构的影响

2.4.1 OTU Venn图分析

OTU Venn图可以直观反映样本中物种的组成相似性及重叠情况。由图3可知，4 组小鼠肠道菌群中共有的OTU为805个，M组特有2 285个，C组特有1 545个，PCa组特有3 089个，Ca组特有2 034个，OTU数量最多的为PCa组，最少的为C组。可见，各组小鼠肠道菌群物种组成差异性较大，卵巢切除导致了小鼠肠道菌落组成的变化，补充CP和钙尔奇D可以激活某些肠道菌成为优势菌。

图3 小鼠肠道菌群OTU水平的Venn图Fig. 3 Venn diagram showing the unique and shared OTU in the intestinal flora among different groups of mice

2.4.2 Alpha多样性分析

Alpha多样性分析中Chao1指数和Observed species指数代表菌群的丰富度。由图4可知，M组Chao1指数和Observed species指数最低，PCa组Chao1指数和Observed species指数显著高于M组（＜0.05），这表明卵巢切除小鼠肠道菌群丰富度降低，补充CP使OP小鼠肠道群落丰富度增加。Shannon指数和Simpson指数能够反映群落的多样性，二者在本研究各组间不具有统计学意义（＞0.05），表明切除卵巢、补充CP和钙尔奇D没有使小鼠肠道菌群的多样性发生变化。

图4 小鼠肠道菌群Alpha多样性的分析Fig. 4 Alpha diversity analysis of intestinal flora in mice

2.4.3 Beta多样性分析

Beta多样性可以评估不同组间微生物群落间的差异，本研究通过主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）分析Beta多样性。由图5可知，各组样品明显分隔，M组主要分布于左上象限，其中1个样品靠近Ca组样品，可能由个体差异导致；C组分布于右下象限，Ca组分布于右上象限，PCa组分布于左下象限。

图5 对小鼠肠道菌群Beta多样性的分析Fig. 5 Beta diversity analysis of intestinal flora in mice

2.4.4 分类学组成分析

本研究从门和属水平考察了CP对OP小鼠肠道菌群种类和丰度的影响，菌群门水平的组成如图6A所示，拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）在各组菌群总量中均超过90%，为肠道优势菌门，不同组中这两种菌的相对丰度分别为M组34.72%、46.44%，Ca组64.39%、29.04%，PCa组55.09%、37.99%，C组55.46%、39.78%。肠道菌群失调时厚壁菌门和拟杆菌门丰度比值（Firmicutes/Bacteroidetes，F/B）升高，本研究中M组F/B值为1.34±0.04、C组为0.72±0.02、PCa组为0.69±0.01、Ca组为0.45±0.01，M组高于C组，PCa组和Ca组低于M组，可见卵巢切除导致了小鼠肠道菌群失调，补充CP和钙尔奇D改变了OP小鼠肠道菌群的分类学门水平组成，改善了肠道菌群的组成结构。

肠道菌群多样性属水平的分布见图6B，Ca、PCa组和C组3 组中相对丰度排名前两位的菌群均为乳酸杆菌（）、普雷沃菌（），M组为乳酸杆菌、螺杆菌（）。与C组相比，M组小鼠肠道菌群中的乳酸杆菌相对丰度下降，拟杆菌（）和螺杆菌相对丰度升高；与M组比，PCa组乳酸杆菌和普雷沃菌相对丰度升高、拟杆菌相对丰度下降，Ca组普雷沃菌相对丰度升高，乳酸杆菌和拟杆菌相对丰度下降。乳酸杆菌是肠道的益生菌，可以促进短链脂肪酸分泌，降低肠道pH值，提高肠腔内钙的溶解度，增强钙细胞旁路的被动转运，抑制和消除条件致病菌；普雷沃菌可以调节雌激素缺乏导致的肠道菌群失调，减少肠壁中的炎性细胞因子分泌，促进成骨细胞增殖。螺杆菌是常见的致病菌，与很多疾病的发生相关。可见，卵巢切除后小鼠肠道菌群中条件致病菌数量增加，肠道微生态健康失衡，这与张广文等研究结果相似，补充CP可促进乳酸杆菌、普雷梭菌等益生菌的生长，抑制条件致病菌在肠道的定植与繁殖，改善小鼠肠道菌群紊乱。

图6 小鼠肠道菌群在门、属水平上的分布Fig. 6 Distribution of intestinal flora in mice at the phylum and genus levels

2.4.5 组间差异物种鉴定

利用线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）可以发现组间丰度有显著差异的物种，本研究设定线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）值为3.0。由图7可见，本研究中组间差异物种的影响程度由大到小排序，M组为螺杆菌属（）、胃瘤球菌属（）、-变形菌纲（Deltaproteobacteria)、脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）、布劳特氏菌（Blautia）、紫单胞菌科（Porphyromonadaceae）、科林斯菌（）、罕见小球菌属（）、丹毒丝菌科梭菌属（）；Ca组为另枝菌属（）、嗜糖假单胞菌属（)、AF12；PCa组为普雷沃菌属（）；C组无LDA分数大于3的菌种。螺杆菌属、紫单胞菌科在代谢紊乱或炎性反应时相对丰度增加；-变形菌纲的细胞膜中含有大量脂多糖，可激活免疫系统，导致炎性细胞因子的产生；脱硫弧菌科影响肠道通透性；科林斯菌参与胶原的降解，可以降低紧密连接蛋白的表达并生成破坏胶原蛋白的产物，增加肠壁通透性，导致炎性疾病的发生和持续；丹毒菌科与IL-1β浓度增加呈正相关，在炎性反应过程中丰度增加。布劳特氏菌和罕见小球菌属可以产生短链脂肪酸，降低肠腔内pH值，升高游离钙离子浓度，本研究中其分布增加可能与缺乏钙而引起的补偿调节有关。可见，M组小鼠肠道菌群组成成分发生明显改变，多种致病菌群丰度升高，肠道菌群失调，肠道中能分解胶原蛋白的菌数量增多。另枝菌属是一种兼性致病菌，包含减弱免疫反应和增强免疫反应的菌属，该菌在丰度适宜时有益于健康，但若丰度过高，可损害肠道屏障，引起炎性病变；嗜糖假单胞菌属和AF12的功效尚不明确；普雷沃菌属可抑制肠道菌群结构紊乱。由此可见，补充CP促进了肠道益生菌的繁殖，抑制了条件致病菌的定植与繁殖，改善了肠道的菌群结构，促进了肠道微生态环境恢复健康，而补充钙尔奇D仅抑制了条件致病菌的生长，这与小鼠肠道菌群的分类学组成分析结果一致。

图7 小鼠肠道菌群组间差异显著性分析Fig. 7 Analysis of significant differences in intestinal flora among mouse groups

3 结 论

本实验研究CP对OP小鼠股骨生物力学特性、骨微结构、血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和肠道菌群结构的影响，得到如下主要结论：1）CP可以提高OP小鼠股骨的抗弯曲能力和抗外压能力，增加骨量和修复骨微结构。2）CP可以减少OP小鼠血清炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，降低骨吸收，促进骨形成。3）CP可以改变OP小鼠肠道的菌群结构，促进益生菌的生长，抑制条件致病菌在肠道的定植与繁殖。因此，补充CP可以缓解卵巢切除诱导的OP，其作用机制可能与减少血清中炎性细胞因子的分泌、调节肠道菌群相关。