外源褪黑素对‘南果梨’果实贮藏品质和细胞壁降解酶的影响

刘佳欣，李灿婴,2，蒋超男，李伊涵，程 园，葛永红,2,*

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121013；2.生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013）

‘南果梨’（后文简称南果梨）属于蔷薇科（Rosaceae）梨属（）植物，果实营养丰富、香气浓郁、爽口多汁、略带酒香味，深受消费者喜爱。新鲜采摘的南果梨果皮呈绿黄色，果实脆而硬，并且风味淡，常温贮藏10～15 d果皮变金黄色，散发出特有的芳香气味，达到最佳可食度。南果梨属于呼吸跃变型果实，采后旺盛的呼吸代谢加速了果实体内营养物质的消耗，从而降低了果实品质并缩短贮藏期。

果肉软化是果实后熟的重要标志之一，不仅受果实的乙烯代谢、蒸腾作用和呼吸作用的影响，而且与果胶物质、纤维素、半纤维素的结构和含量变化密切相关。刘帅民研究发现，半纤维素分子质量随果实软化逐渐降低，且小分子质量的半纤维分子片段含量明显增加。多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果胶甲酯酶（pectin methylesterase，PME）、果胶裂解酶（pectin lyase，PL）、纤维素酶（cellulase，Cx）和半纤维素酶等可逐步水解细胞壁物质并最终生成单糖，引起组织的软化。已有研究表明，1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）处理有效抑制了南果梨果实Cx、PG和PME等细胞壁降解酶的活力，同时延缓了纤维素和果胶物质的降解。程玉豆等研究发现，1-MCP结合延迟冷藏能够维持‘早红考密斯’梨货架期较高的果实硬度和较低的乙烯生成速率，同时还能减少果实腐烂，但较长的冷藏处理时间加速了乙烯生成速率和果实软化。

褪黑素化学名称为-乙酰基-5-甲氧基色胺，是一种吲哚类色胺，属于内源性激素，能够延缓猕猴桃、石榴、油桃、草莓、桃、柑橘、枣和枸杞等果实的采后衰老。Hu Wei等研究发现，外源褪黑素可抑制香蕉果实乙烯生物合成和淀粉转化为可溶性糖，有助于延缓果实成熟和保持果实品质。此外，外源褪黑素处理能够推迟梨和枣果实乙烯释放高峰和降低呼吸速率，同时提高果实抗氧化酶活力，改善细胞氧化还原状态，从而延缓果实成熟和生理代谢紊乱。采前褪黑素处理可促进番茄果实糖分和有机酸积累，提高番茄红素和抗坏血酸含量。然而，目前鲜见外源褪黑素在南果梨采后贮藏品质及果实软化方面的相关研究。

本实验研究褪黑素处理对南果梨果实常温贮藏期间质量损失率、硬度、可溶性固形物质量分数等指标及PG、PME、Cx和-葡萄糖苷酶（-glucosidase，-glu）活力和基因表达的影响，为南果梨果实的采后品质保持提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南果梨果实采自锦州市罗罗堡镇；褪黑素、果胶、3,5-二硝基水杨酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷 北京索莱宝生物科技有限公司；浓硫酸、浓盐酸 锦州古城化学试剂厂；磷酸钠 山东西亚化工有限公司；交联聚乙烯吡咯烷酮上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、Fast Quant-RT试剂盒、Super Real PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 仪器与设备

H1650R低温离心机 湘仪离心机仪器有限公司；UV-2550紫外-可见分光光度计 岛津仪器（苏州）有限公司；7820气相色谱仪 美国安捷伦公司；5424R小型冷冻离心机 德国Eppendorf公司；GY-1水果硬度计杭州托普仪器有限公司；WYT-32阿贝折光仪 厦门中村光学仪器厂；CR-400色差计 柯尼卡美能达（南京）有限公司；Light Cycle 96实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 瑞士罗氏公司。

1.3 方法

1.3.1 果实预处理

南果梨果实在商业成熟度时采收，纸箱（50个/箱）包装后当天运抵实验室进行处理。选取质量基本一致、颜色均匀、无机械伤和病虫害的南果梨果实，分别用25 μmol/L褪黑素（含0.01 mL/L吐温20）和蒸馏水（对照）常温浸泡10 min。待室温晾干后装入600 mm×400 mm的聚乙烯（polyethylene，PE）袋，每个袋子装20个果实，于（21±1）℃、相对湿度（45±5）%条件下贮藏待用，共处理果实130个。

参考文献[20]的方法。于贮藏第0、3、6、9、12天分别取20个褪黑素处理和对照组果实，切取果实中部皮下0.2～0.8 mm处果肉组织，液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 质量损失率及乙烯释放速率测定

贮藏第0、3、6、9、12天分别取10个对照和褪黑素处理果实称量质量，重复3 次。按下式计算质量损失率。

乙烯释放速率测定参照文献[21]并稍作修改。分别于贮藏第0、3、6、9、12天取对照和褪黑素处理果实30个，在5 L干燥器中放入南果梨，以10个为一组并密封，1 h后用排水集气法收集气体，用气相色谱仪测定乙烯含量。乙烯释放速率以μL/（kg·h）表示。

1.3.3 色泽测定

参考文献[22]的方法，在贮藏第0、3、6、9、12天，分别随机选取15个对照和褪黑素处理果实，围绕果实赤道区域取3 点采用CR400型色差计测定果皮（亮度）、（红绿度）、（黄蓝度）值。

1.3.4 可滴定酸及叶绿素水平测定

可滴定酸质量分数和叶绿素（叶绿素a和叶绿素b）含量测定分别参照文献[23]和文献[24]。

1.3.5 果肉硬度及可溶性固形物质量分数测定

参考文献[20]的方法测定果肉硬度及可溶性固形物质量分数。

1.3.6 水溶性果胶及不溶性果胶质量分数的测定

水溶性果胶、不溶性果胶质量分数测定均参考文献[25]的方法，将样品（3.0 g）研磨呈匀浆后在沸水浴中保温30 min，冷却后在4 500 r/min离心15 min，蒸馏水定容上清液至100 mL，即得到水溶性果胶。向上述留有沉淀的离心管中加入25 mL、0.5 mol/L硫酸溶液，在沸水浴中加热1 h后取出冷却至室温，4 500 r/min离心15 min，用蒸馏水将上清液定容至100 mL，得到不溶性果胶。用半乳糖醛酸绘制标准曲线，以生成半乳糖醛酸的质量分数表示水溶性果胶和不溶性果胶质量分数。

1.3.7 细胞壁降解酶活力及相关基因表达分析

PG、PME、Cx和-glu的粗酶液提取及活力测定均参考文献[24]的方法，以葡萄糖绘制标准曲线。PG和PME活力单位为mg/（h·g），即37 ℃条件下1 g果实组织1 h内催化底物分解形成葡萄糖的质量。Cx和-glu活力测定采用DNS法，单位为mg/（h·g）。各细胞壁降解酶活力均以鲜质量计。

参考RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书，从果肉组织中提取总RNA。用Fast Quant-RT试剂盒合成第一链cDNA。引物序列设计（表1）及合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。参照Super Real PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR。PCR反应混合物在95 ℃下预培养30 s，用三步扩增法分析每个基因：95 ℃孵育30 s；95 ℃变性持续5 s；降到退火温度后持续30 s；在72 ℃下延伸30 s。以为内参基因，采用2法计算基因相对表达量。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR

1.4 数据统计与分析

实验设置3 次重复，结果以平均值±标准差表示。采用Excel 2010软件处理数据，采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析和皮尔逊相关性分析，采用检验进行显著性分析，＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 果实乙烯释放速率和质量损失率的变化

乙烯促进果实后熟衰老，抑制乙烯生成可以延长果实贮藏寿命。图1A中乙烯释放速率在贮藏0～9 d呈上升趋势，在第9天达到高峰后下降，且褪黑素处理果实乙烯释放速率始终低于对照组。在贮藏第9天，对照组乙烯释放速率是褪黑素处理果实的1.3 倍。水分蒸腾、呼吸消耗及其他生理代谢是果实采后质量损失的主要原因，质量损失率是反映果实新鲜度的重要指标。图1B中对照与褪黑素处理南果梨果实质量损失率整体无显著差异（＞0.05）。

图1 外源褪黑素对南果梨果实乙烯释放速率（A）和质量损失率（B）的影响Fig. 1 Effect of exogenous melatonin treatment on ethylene release rate (A)and mass-loss rate (B) of ‘Nanguo’ pear fruit

2.2 果实色泽的变化

果实表皮的色泽可以直观地反映果实的成熟度和新鲜度。南果梨果实采后果皮颜色由绿转黄，质地逐渐变软，表现出果实特有的质地和风味。由图2可知，对照组果实、和值在整个贮藏期间均呈上升趋势，且对照组*、*值始终高于褪黑素处理组，两组间、值在贮藏6～12 d具有显著性差异（＜0.05），而褪黑素处理组*值始终高于对照组，说明褪黑素处理可以延缓南果梨果皮颜色转黄，从而延缓衰老。

图2 外源褪黑素对南果梨果实L*（A）、a*（B）和b*值（C）的影响Fig. 2 Effect of exogenous melatonin treatment on L* (A), a* (B), and b* (C) values of ‘Nanguo’ pear fruit

2.3 果实可滴定酸、叶绿素水平的变化

可滴定酸水平是影响果实风味品质的重要指标之一。由图3A可知，对照和褪黑素处理果实可滴定酸质量分数在贮藏0～12 d逐渐下降，且褪黑素处理显著提高了贮藏6～12 d果实可滴定酸质量分数（＜0.05），说明褪黑素处理有利于延缓南果梨果实可滴定酸质量分数的下降。叶绿素是构成果蔬的色素之一，主要由叶绿素a和叶绿素b构成，随着果实后熟衰老逐渐被分解，使果实退绿而显示出类胡萝卜素的黄色。由图3B、C可知，褪黑素处理和对照组果实中叶绿素a和叶绿素b含量在贮藏0～12 d均呈下降趋势，且褪黑素处理明显抑制了叶绿素含量的下降。由此说明外源褪黑素通过抑制南果梨果实果皮叶绿素的降解，从而延缓果实转黄。

图3 外源褪黑素对南果梨果实可滴定酸（A）、叶绿素a（B）和叶绿素b（C）水平的影响Fig. 3 Effect of exogenous melatonin treatment on titratable acid (A),chlorophyll a (B) and chlorophyll b (C) contents in ‘Nanguo’ pear fruit

2.4 果肉硬度和可溶性固形物质量分数的变化

果实成熟度增加会使其逐渐软化而失去光泽。由图4A可知，在贮藏0～12 d褪黑素处理和对照组果实的果肉硬度均呈下降趋势，褪黑素处理在贮藏3～12 d显著抑制了果肉硬度的下降（＜0.05）。果实中的可溶性固形物主要由可溶性糖构成，其种类和含量影响果实的口感。由图4B可知，对照和褪黑素处理果实可溶性固形物质量分数在贮藏0～12 d逐渐升高，其间，褪黑素处理在贮藏6～12 d显著抑制了可溶性固形物质量分数的升高（＜0.05）。

图4 外源褪黑素对南果梨果实果肉硬度（A）和可溶性固形物质量分数（B）的影响Fig. 4 Effect of exogenous melatonin treatment on flesh firmness (A)and soluble solid content (B) of ‘Nanguo’ pear fruit

2.5 水溶性果胶和不溶性果胶质量分数的变化

不溶性果胶可保持果实的硬度，但随着果实贮藏时间的延长，不溶性果胶（原果胶）逐渐转化为水溶性果胶，在PG作用下分解为多聚半乳糖醛酸，导致细胞间松弛，引起果实软化。如图5A所示，褪黑素处理和对照组果实水溶性果胶质量分数在贮藏0～12 d呈逐渐上升趋势，但褪黑素处理在贮藏6～12 d显著抑制了水溶性果胶质量分数的升高（＜0.05），贮藏第9天对照组果实水溶性果胶质量分数为褪黑素处理的1.18 倍。由图5B可知，不溶性果胶质量分数在贮藏期间整体呈下降趋势，且褪黑素处理果实不溶性果胶质量分数始终高于对照组果实，且在贮藏3～12 d差异显著（＜0.05），褪黑素处理果实不溶性果胶质量分数分别是相同贮藏时间对照组果实的1.04、1.12、1.21、1.17 倍。

图5 外源褪黑素对南果梨果实水溶性果胶（A）和不溶性果胶（B）质量分数的影响Fig. 5 Effect of exogenous melatonin treatment on the contents of waterinsoluble pectin (A) and water-soluble pectin (B) in ‘Nanguo’ pear fruit

2.6 果实细胞壁降解酶活力及基因表达的变化

2.6.1 PME、PG、Cx和-葡萄糖苷酶活力的变化

PME和PG是分解果胶物质的关键酶，PME通过使果胶去酯化，产生水溶性的果胶酸和甲醇，PG进一步将果胶分解为小分子物质半乳糖醛酸。如图6A所示，对照和褪黑素处理果实PG活力在贮藏0～12 d均升高，其中褪黑素处理果实PG活力在贮藏3～12 d显著低于对照组果实（＜0.05）。如图6B所示，PME活力的整体变化趋势和PG一致，但褪黑素处理仅在贮藏6～12 d显著抑制PME活力升高（＜0.05）。纤维素和半纤维素能在Cx和-glu的作用下最终水解为单糖，从而破坏细胞壁的成分和结构，使果实软化。如图6C所示，褪黑素处理与对照组果实Cx活力在贮藏0～12 d均呈升高趋势，并且褪黑素处理在贮藏6～12 d显著降低了果实Cx活力（＜0.05）。如图6D所示，南果梨果实的-glu活力在贮藏0～12 d呈逐渐升高趋势，但褪黑素处理显著抑制了贮藏6～12 d果实-glu活力（＜0.05）。

图6 外源褪黑素对南果梨果实 PG（A）、PME（B）、Cx（C）和β-glu（D）活力的影响Fig. 6 Effect of exogenous melatonin treatment on the activities of PG(A), PME (B), Cx (C) and β-glu (D) in ‘Nanguo’ pear fruit

2.6.2、和表达的变化

由图7A可知，对照和褪黑素处理果实相对表达量在贮藏0～12 d逐渐升高，但在贮藏6～9 d褪黑素处理显著抑制了表达（＜0.05）。由图7B可知，对照和褪黑素处理果实相对表达量在贮藏0～9 d逐渐升高，随后开始下降，并且褪黑素处理显著降低了贮藏3～12 d果实相对表达量（＜0.05）。由图7C可知，相对表达量在贮藏0～12 d呈先下降后升高再下降的趋势，其中褪黑素处理果实表达量在贮藏3～12 d显著低于对照组果实（＜0.05）。由图7D可知，褪黑素处理显著下调了贮藏3～12 d果实的表达（＜0.05），褪黑素处理果实相对表达量分别是对照的2.38、2.70、1.96、1.83 倍。由图7E可知，褪黑素处理降低了果实相对表达量，并且在贮藏3、6 d和9 d显著低于对照（＜0.05），分别为对照组的1.2、1.4、2.2 倍。

图7 外源褪黑素对南果梨果实PcPG1（A）、PcPG2（B）、PcPME（C）、Pcβ-glu13（D）和Pcβ-glu40（E）表达的影响Fig. 7 Effect of exogenous melatonin treatment on PcPG1 (A),PcPG2 (B), PcPME (C), Pcβ-glu13 (D) and Pcβ-glu40 (E) expression in‘Nanguo’ pear fruit

2.7 相关性分析结果

果肉硬度、不同果胶质量分数和相关酶活力的相关性分析结果如表2所示，果肉硬度与不溶性果胶质量分数呈极显著正相关（＜0.01），与不溶性果胶质量分数、PG、PME、Cx和-glu活力呈极显著负相关（＜0.01），水溶性果胶质量分数与PG、PME、Cx和-glu活力呈极显著正相关（＜0.01），与不溶性果胶质量分数呈极显著负相关（＜0.01）。不溶性果胶质量分数与PG、PME、Cx、-glu活力均呈极显著负相关（＜0.01）。PG活力与PME、Cx和-glu活力呈极显著正相关（＜0.01），PME活力与Cx、-glu活力呈极显著正相关（＜0.01），Cx活力与-glu活力呈极显著正相关（＜0.01）。由此表明，果胶物质的降解与细胞壁降解酶活力的变化密切相关。

表2 果肉硬度、不同果胶质量分数和相关酶活力的相关性分析结果Table 2 Correlation analysis of flesh firmness, different pectin content and related enzyme activities

3 讨 论

衰老是果蔬采后的正常生理代谢过程，与果实软化、乙烯代谢和呼吸代谢密切相关。因此，采用合适的保鲜措施进行采前或采后处理抑制呼吸和乙烯代谢，可以减缓果实的软化及品质下降。本研究发现，采后褪黑素处理不影响乙烯释放高峰出现时间，但明显抑制了南果梨果实乙烯释放速率。TangQi等研究发现，采后褪黑素处理显著抑制了大枣果实乙烯释放速率和呼吸速率。此外，褪黑素处理还能抑制芒果果实乙烯释放速率，从而延缓果实衰老。本研究发现，褪黑素处理对南果梨果实质量损失率没有显著影响（＞0.05），这与唐琦在大枣中的研究结果一致。由此推测，外源褪黑素可能改变了果实的生理代谢途径，而对水分蒸腾没有明显的影响，但详细的机理还需进一步研究。本研究发现，外源褪黑素处理延缓了果实亮度的降低，抑制了值的上升和值的下降，同时，褪黑素处理还抑制了果实叶绿素a和叶绿素b含量的下降。由此说明，外源褪黑素能够降低果实中叶绿素的降解速度，从而延缓果实的黄化。植物中，叶绿素在一系列降解酶的作用下逐步分解为无荧光叶绿素降解物，从而影响叶绿素含量及果实色泽变化。Tan Xiaoli等发现褪黑素处理菜心可以显著延缓叶绿素分解，延缓其衰老进程。此外，外源褪黑素处理还能抑制采后青花菜、菜心的叶绿素降解和黄花率的升高。

有机酸在植物的生物和非生物胁迫中发挥重要作用，其含量是衡量果蔬营养品质的重要指标。褪黑素处理延缓了南果梨果实中可滴定酸质量分数的下降。草莓果实中的研究也发现，采后褪黑素处理保持了果实相对较高的可滴定酸水平。崔建潮等研究发现，采后碳酸氢钠和碳酸钠处理能够延缓南果梨果实贮藏期间的果肉硬度和可溶性固形物质量分数的下降。此外，外源褪黑素处理还能降低果实的腐烂指数，抑制呼吸速率，延缓果实硬度的下降。淀粉降解是可溶性固形物含量增加的原因之一，褪黑素处理可能抑制了淀粉的降解过程。褪黑素处理还可以有效降低贮藏期间香菇的呼吸强度，延缓香菇子实体硬度和色泽的下降，维持香菇的外观品质。

细胞壁降解酶催化果胶、半纤维素和纤维素等细胞壁组分降解是果实软化的根本原因，细胞因中胶层溶解使细胞间产生空隙，导致果肉组织瓦解浆化。本研究发现，外源褪黑素显著抑制了南果梨果实硬度下降（＜0.05），同时抑制了果胶物质、纤维素和半纤维素降解相关酶PG、PME、-glu和Cx的活力和基因表达。已有研究表明，褪黑素处理能通过延缓细胞壁多糖降解酶活力而抑制芒果果实软化。果实后熟衰老过程中，PG参与果胶物质的降解，使细胞壁结构解体，导致果实软化，-glu主要改变果胶分子相互作用，导致细胞壁的完整性下降。纤维素在Cx水解作用下破坏果实细胞壁网络结构。海藻酸钠/纳米TiO（sodium alginate/nano-TiO，SA/TiO）复合涂膜处理与1-MCP和自发气调包装（modified atmosphere packaging，MAP）结合处理分别可以有效地抑制采后番木瓜和‘空心李’果实中PG、PME和Cx的活力，延缓不溶性果胶和纤维素的水解，保持较完整的细胞壁结构，从而维持果实硬度。刘帅民研究发现，褪黑素处理有效缓解PME活力下降，延缓成熟过程中果实快速软化。还有研究证明，外源褪黑素处理通过下调桃、梨果实中、和表达维持果实硬度，进而抑制果实软化进程。不溶性果胶通过连接果实的细胞，来保持果实的硬度，但是随着果实贮藏时间的延长，不溶性果胶逐渐向水溶性果胶转化，造成果实细胞间松弛，引起果实软化。外源褪黑素处理减缓了水溶性果胶产生的同时维持了不溶性果胶的含量。这与唐琦研究结果相似，褪黑素处理后的果实延缓了不溶性果胶质量分数下降，且抑制了水溶性果胶质量分数上升。这些结果表明，褪黑素处理延缓南果梨果实贮藏过程中硬度的下降与其抑制细胞壁降解酶活力的升高密切相关。

外源褪黑素处理明显抑制南果梨果实乙烯的释放，提高值，降低值，提高叶绿素含量，从而延缓果实黄化。褪黑素还通过抑制果实PME、PG、Cx和-glu的活力及基因表达，延缓不溶性果胶的降解和水溶性果胶质量分数的上升，从而保持较高的果实硬度。