基于网络药理学探讨玫瑰花抗抑郁物质基础及作用机制

梁梦梦，邵欣欣，陈聪，张松，张广忠，李佳*

(1. 山东中医药大学，山东 济南 250355；2. 济南玖玫玫瑰有限公司，山东 济南 250400)

抑郁症是一种以显著而持久的心情低落为主要临床症状的常见病，患者通常表现为兴趣明显减少、存在睡眠障碍，严重者会出现自残、自杀倾向[1]。据世界卫生组织估计，世界上患有抑郁症的总人数达3.22亿，其中近一半的人生活在东南亚和西太平洋区域，反映出这两个区域人数相对较多[2]。

目前传统抗抑郁药虽有一定疗效，但普遍存在复发率高、治愈率低、副作用大等问题[3]，开发治疗抑郁症的新药显得尤为重要。中医药治疗抑郁症以药理成分多、多靶点治疗、毒副作用小为特点，具有“增效减副”的优势[4]。

玫瑰花为蔷薇科植物玫瑰RosarugosaThunb.的干燥花蕾，性温，味甘、微苦，入肝脾二经，具有行气解郁、和血、止痛之功，可用于治疗肝胃气痛、食少呕恶、月经不调、跌扑伤痛等症[5]，主产于山东平阴。现代药理研究亦表明，玫瑰花所含有的黄酮类、维生素、氨基酸、挥发油等成分，具有抗抑郁、抗肿瘤、抗氧化、抑菌、调节血脂、降血糖等药理活性[6-7]。但是，玫瑰花抗抑郁的物质基础及作用机制尚不够明确。因此，本研究借助网络药理学方法，对玫瑰花抗抑郁物质基础及作用机制进行研究，旨在为抗抑郁新药研发提供理论依据及新的研究思路。

1 资料来源与筛选标准

1.1 抗抑郁单体收集与筛选

本研究选择信息比较全面的中国知网(China national knowledge infrastructure，CNKI)数据库为数据来源，以“TKA =‘抗抑郁’and TKA =‘单体’”为检索式。其中，文献的纳入标准：(1)实验性论文和专利；(2)实验步骤的各项信息较完整；(3)有明确的抗抑郁作用的单体。排除标准：(1)实验对象为单味药、复方或中西药联用类论文；(2)综述类文献；(3)实验数据或指标有误的论文。收集并筛选符合标准的抗抑郁单体。

2 研究方法

2.1 化学结构相似性比对

将抗抑郁单体与玫瑰花化合物结构导入化学结构比对软件Data Warrior中，进行基于结构片段的相似性比对，选择大于95% 为相似度阈值[8]，得到其相似性比对的结果，以探索已具备研究基础的化合物与玫瑰花化合物的相似程度，分析玫瑰花所含化合物临床抗抑郁应用潜力。

2.2 玫瑰花的抗抑郁成分-靶点关联分析

经抗抑郁单体和玫瑰花化合物结构相似性比对，获得玫瑰花化合物中与抗抑郁单体具有高度结构相似性成分，对其相关靶点以Probability≥0.068为筛选标准，最终筛选出玫瑰花的抗抑郁成分，并预测其相关靶点，构建玫瑰花的抗抑郁成分-靶点数据库。将经筛选后的玫瑰花的抗抑郁成分及对应靶点导入 VOS viewer 1.6.13进行关联规则分析，绘制玫瑰花的抗抑郁成分与靶点关联规则图谱，分析玫瑰花的抗抑郁成分与靶点的内在联系。借助频数分析，统计高频成分及靶点，绘制频数分布图。

2.3 构建玫瑰花成分-靶点-疾病网络

2.3.1 玫瑰花的作用靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络构建

将玫瑰花的抗抑郁成分作用靶点导入STRING(https://string-db.org)数据库，并限定研究物种来源于人种(homo sapiens)，借助此蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析平台构建 PPI 网络。

2.3.2 玫瑰花的抗抑郁成分-靶点-疾病相互作用网络构建

将玫瑰花的抗抑郁成分作用靶点导入DAVID (https://david.ncifcrf.gov)数据库，借助DAVID子库GAD进行疾病富集分析，构建靶点-疾病数据库。将玫瑰花的抗抑郁成分-靶点数据库、靶点-疾病数据库及上述PPI数据库，导入网络可视化软件 Cytoscape3.7.2，并进行融合，构建玫瑰花的抗抑郁成分-靶点-疾病相互作用网络。其中成分、靶点、疾病被表示为网络中的节点，其之间的相互联系以边表示。

2.4 核心靶点筛选及核心成分-靶点-疾病相互作用网络构建

利用DAVID 数据库搜索关键词“depression,”查找与抑郁症相关的靶点，并构建抑郁症-靶点数据库。同玫瑰花抗抑郁成分-靶点数据库合并，去除重复和假阳性的靶点，最后与活性成分相关的靶点相映射，获得玫瑰花与抑郁症相关的核心成分和相关靶点，构建玫瑰花抗抑郁核心成分-靶点数据库。

将核心靶点导入STRING数据库，限定研究物种来源于人种(homo sapiens)，构建核心靶点 PPI 相互作用网络，将该相互作用关系同抑郁症-靶点数据库、玫瑰花的抗抑郁核心成分-靶点数据库分别导入Cytoscape3.7.2，合并，以构建核心成分-核心靶点-疾病相关作用网络，其中玫瑰花的核心成分、核心靶点、疾病被表示为网络中的节点，其之间的相互联系以边表示。

2.5 通路富集分析

将玫瑰花的核心靶点导入 DAVID数据库进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG) 通路富集分析，阈值为P<0.01，限定研究物种来源于人种(homo sapiens)。

2.6 分子对接

对玫瑰花核心成分及核心靶点以节点度值(degree)进行排布，筛选节点度值前三的靶点及成分为玫瑰花的抗抑郁关键靶点及关键成分，于蛋白质晶体库PDB(https://www1.rcsb.org/)筛选出关键靶点相对应的蛋白质晶体结构，运用分子对接软件Discovery Studio 2017 R2中的Receptor-Ligand International模块，对玫瑰花关键靶点及关键成分分别进行CDOCKER分子对接。蛋白的活性位点以晶体结构中自身标注的原配体作用的活性氨基酸位点为中心，进行“活性口袋”构建，使小分子通过CDOCKER算法模块与“活性口袋”中的氨基酸进行对接，参数设置：Pose Cluster Radius设置为0.5，Random Conformations 设置为10，Orientations to Refine设置为10，其余维持默认参数不变。

3 研究结果

3.1 玫瑰花的抗抑郁化学成分

经玫瑰花化学成分与抗抑郁单体结构片段相似性比对(图1)筛选，结果显示，玫瑰花成分中与抗抑郁单体具有高结构相似性(>95%)成分27个(详见OSID附表1)，且主要为黄酮类、萜类、苯丙素类、甾体类、多酚类(表1)。

图1 抗抑郁单体与玫瑰花成分相似结构性比对Fig.1 The similar structural comparison of antidepressant monomers and Rosae Rugosae Flos ingredients

表1 玫瑰花的抗抑郁相关化合物分类Table 1 Classification of antidepressant related compounds in Rosae Rugosae Flos

3.2 玫瑰花的抗抑郁成分与靶点的关联关系

以玫瑰花的抗抑郁成分27个，对应作用靶点255个，构建玫瑰花的抗抑郁成分-靶点数据库，并导入VOS viewer 1.6.13，发现由于化学成分结构的多样性，从而导致其作用靶点的差异性(图2)。如图显示，甾体类化合物与靶点P60568更为相关，萜类以及多酚类化合物与靶点Q14534、P04745更为相关，而黄酮类化合物以其天然的结构优势涉及多种药理活性，提示此类化合物具备多样的生物活性。

根据玫瑰花的抗抑郁活性成分及抑郁靶点关联分析(图2)，将显著关联结果进行频数统计，得到玫瑰花的抗抑郁活性成分-靶点频数分析图(图3)，结果显示，C1成分(黄酮类化合物)和C5成分(酚酸类化合物)对于抑郁相关靶点均具备较高的特异性，其中黄酮类化合物覆盖更多的靶点。

图2 玫瑰花的抗抑郁活性成分-靶点关联分析Fig.2 The correlation analysis of Rosae Rugosae Flos antidepression ingredients and targets

图3 玫瑰花的抗抑郁活性成分-靶点频数分析Fig.3 The frequency chart of Rosae Rugosae Flos antidepression ingredients and targets

3.3 玫瑰花的抗抑郁成分主要作用通路

以Cytoscape3.7.2构建玫瑰花抗抑郁成分-靶点-疾病相互作用网络(图4 (a))，结果显示，来源于玫瑰花的27个成分与255个靶点发生相互作用，并与986种疾病产生关联，其中包含抑郁症。通过DAVID数据库进行KEGG通路富集分析(图4 (b))，发现玫瑰花的抗抑郁成分主要通过氮素代谢，类固醇激素生物合成，神经活性配体-受体的相互作用，花生四烯酸代谢等通路发挥治疗疾病的作用。

注:(a)中红色为27个玫瑰花抗抑郁成分，玫红色为255个与玫瑰花发生相互作用的靶点，蓝色为与255个靶点相关联的986种疾病(其中包括抑郁症)。图4 玫瑰花的抗抑郁成分-靶点-疾病相互作用网络及其抑郁相关靶点KEGG通路分析Fig.4The antidepression ingredients-targets-disease interaction network and the depression-related targets-path analysis of Rosae Rugosae Flos

3.4 玫瑰花抗抑郁核心靶点及核心成分

从玫瑰花的抗抑郁成分-靶点-疾病相互作用网络(图4(a))中筛选出与抑郁相关的子网络(玫瑰花的抗抑郁核心成分-靶点-疾病相互作用网络)，将核心靶点 PPI关系同抑郁症-靶点数据库、玫瑰花的抗抑郁核心成分-靶点数据库分别导入Cytoscape3.7.2，合并，构建玫瑰花的抗抑郁核心成分-核心靶点-疾病相关作用网络(图5 )。图5 网络中有节点48个(核心成分17个，核心靶点31个)，包含194条边。借助KEGG对玫瑰花抗抑郁核心靶点进行通路富集分析，得到图6，发现玫瑰花治疗抑郁症的活性成分主要通过HIF-1 信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路、催乳素信号通路、多巴胺能神经突触等通路发挥作用。

注:黄色表示玫瑰花，红色表示玫瑰花抗抑郁核心成分(TCMSP 编号活性成分和来自文献自拟编号成分)，蓝色表示玫瑰花治疗抑郁症潜在靶点。图5 玫瑰花的抗抑郁核心成分-靶点-疾病相互作用网络Fig.5 The antidepression core ingredients-targets-disease interaction network

图6 玫瑰花抗抑郁核心靶点KEGG通路分析Fig.6 KEGG pathway analysis for the depression-related core targets of Rosae Rugosae Flos

将抗抑郁核心成分与其作用核心靶点进行频数统计分析，得到抗抑郁核心成分-靶点频数分析图(图7)，结果显示，黄酮类化合物及其相对应的靶点具备更高的特异性。

图7 抗抑郁核心成分-靶点频数分析Fig.7 The frequency chart of antidepression core ingredients-targets

3.5 玫瑰花抗抑郁关键靶点及关键成分

以节点度值进行排布，结果显示节点度值前三的靶点在抑郁症相关子网络中具备突出作用，活性成分degree≥18的具备更好的生物活性。因此，靶点P31749、P35354、P03372、P01375为玫瑰花的抗抑郁关键靶点，活性成分124(来自文献[9]，编号自拟)、MOL000007、MOL000008、MOL000098、MOL000206、MOL000415、MOL000422、MOL000437、MOL004799(来自TCMSP数据库，与数据库提供编号一致)为抗抑郁关键成分(结构见图8)。

图8 玫瑰花抗抑郁关键成分结构图Fig.8 The structure chart of the key antidepressant components of Rosae Rugosae Flos

3.6 分子对接结果

为进一步确认玫瑰花所含抗抑郁成分及其作用靶点，将抗抑郁核心成分、核心靶点进行分子对接，发现9个核心成分中仅有6个成分可与其相关靶点进行对接(表2)。分子对接打分值越高表示吻合性越好，分析发现成分MOL000008，MOL000098，MOL000422与靶点P31749的结合最好(图9)，成分MOL000008，MOL000206，MOL000422与靶点P31749、P03372也可较好结合(图10～11)。

表2 核心靶点分子对接Table 2 Molecular docking results of core targets

图9 靶点P31749 分子对接可视化结果Fig.9 Molecular docking visualization results of target P31749

图10 靶点P35354分子对接可视化结果Fig.10 Molecular docking visualization results of target P35354

图11 靶点P03372分子对接可视化结果Fig.11 Molecular docking visualization results of target P03372

4 讨论

经研究初步判定，玫瑰花所含成分中黄酮类化合物在发挥抗抑郁作用方面更具显著特异性。玫瑰花的抗抑郁活性成分-靶点频数分析结果显示(图3)，C1成分(黄酮类化合物)和C5成分(酚酸类化合物)对于抑郁相关靶点均具备较高的特异性，且黄酮类化合物覆盖更多的靶点。大量报道证明，酚酸类化合物受生物利用度的影响和制约[10]，说明其成药性差，因而不作为首选研究药物和临床前体药物研究的参考。进一步针对玫瑰花抗抑郁核心靶点和核心成分进行分析，发现仅有黄酮类化合物发挥高度特异性(图7)。

迄今为止，从玫瑰花中共分离和检测到的所有成分中黄酮类化合物占比较高，约占40.87%[11]，研究发现该类化合物与抗抑郁化合物显示出高度结构相似性。通过片段结构相似性比对，设置筛选条件为高度结构相似性≥95%，结合其结构特性及相对应的靶点和分子对接结果，发现黄酮类化合物及其相对应的靶点具备更高的特异性。另外已有研究表明，大量的黄酮类物质具有抗抑郁作用，槲皮素[12]和芦丁[13]可通过降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的表达量，缓解抑郁样行为；山柰酚、芹菜素[14-15]则能通过抑制单胺氧化酶(MAO)的表达，显示出抗抑郁活性；金丝桃苷通过影响5-HT系统，显示出抗抑郁作用[16]。然而，玫瑰花作为药食同源中药材之一，具有安全有效的优势，其抗抑郁作用机理的研究不足严重影响了具有较高药用价值和经济价值[17]的玫瑰花药用开发。

药物的药效成分不仅作用于相关靶点，还可以影响靶点相关多个信号通路与代谢途径，进而干扰特定疾病的发生发展。本次研究发现，芹菜素、山柰酚均可作用于靶点AKT1、PTGS2、ESR1，异丁香酚可作用于PTGS2、ESR1，槲皮素可作用于AKT1，异槲皮苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷均可作用于PTGS2。已有研究证实，参与神经生物学过程的蛋白激酶是情感障碍药物治疗、预后、诊断的新靶点[18]。蛋白激酶AKT1是蛋白激酶B的一种亚型，对神经系统细胞的发育、生长和存活起着重要作用，当其在神经系统中的表达显著上调，大鼠抑郁样行为具有明显的缓解趋势[19]。AKT1P还参与到与各种生长因子相关的HIF-1信号通路[20]、与催乳素受体相关的催乳激素信号通路[21]、与神经递质相关的多巴胺能神经突触通路当中，这些通路可能是芹菜素、山柰酚、槲皮素作用于靶点AKT1发挥抗抑郁功效的作用机制。大量证据表明炎症过程和氧化应激反应是抑郁症发病的主要机制，在抑郁症中起着重要的作用，抑郁症所伴随的神经退行性加重，部分是由炎症过程引起的[22]。PTGS2是一种炎性相关酶，在慢性炎症组织中发挥关键作用，参与中枢神经系统神经退行性病变相关的炎症过程[23]。而PTGS2基因编码的环氧合酶-2与MDD发病机制有关[24]。COX-2抑制剂还可以通过调节细胞因子和PGE2发挥抗抑郁作用[25]。本研究发现玫瑰花抗抑郁作用靶点PTGS2参与到催乳激素信号通路当中，此通路可能是芹菜素、异丁香酚、山柰酚作用于靶点PTGS2发挥抗抑郁功效的作用机制。有研究显示，ESR1基因的TT等位基因RS2234693与慢性或重度抑郁症有关[26]。新生儿氯丙咪嗪治疗显著诱导下丘脑中ESR1 mRNA表达增加，并且新生儿氯丙咪嗪治疗(在大脑发育期间)诱导了参与调节抑郁样行为的不同脑区雌激素受体的变化[27]。经 KEGG 通路分析发现玫瑰花抗抑郁作用靶点ESR1可通过催乳激素信号通路发挥抗忧郁作用。此通路可能是芹菜素、异丁香酚、山柰酚作用于靶点ESR1发挥抗抑郁功效的作用机制。

本研究借助网络药理学方法，以结构相似性显著的成分为基础，采用分子对接技术，对玫瑰花抗抑郁物质基础及作用机制进行研究，旨在为明晰玫瑰花抗抑郁作用机理提供理论基础，为抗抑郁新药研发提供理论依据及新的研究思路。