以活性污泥为接种污泥厌氧氨氧化工艺的快速启动及脱氮效能

陈加波，周鑫，李旭

（1 中国人民大学环境学院，北京 100872；2 太原理工大学环境科学与工程学院，山西 晋中 030600；3 山西省市政工程研究生教育创新中心，山西 晋中 030600）

目前，采用生物方法去除废水中的氮是解决富营养化问题的经济有效的途径。厌氧氨氧化（Anammox）是指利用厌氧氨氧化菌（AnAOB）将NH-N在NO-N存在的缺氧条件下转化为N的一种脱氮工艺。Anammox 因其具有节省能源和运营成本的优势已广泛用于高氨氮废水脱氮研究。据统计，在全球范围内，已经有100多个Anammox装置成功运行，用于处理污泥消化液氨氮浓度高（500～2000mg/L） 和碳氮比（C/N） 低的废水。然而对于低浓度废水，Anammox 的应用报道不多。目前保留并富集AnAOB 是Anammox 快速启动的关键。已有研究证实，通过使用颗粒污泥、生物絮凝体和生物膜等方式可以促进AnAOB富集。

生物膜反应器由于污泥浓度高、污泥龄长，经常被用作生长缓慢的微生物富集良好反应器，包括移动床生物膜反应器（moving bed biofilm reactor，MBBR）、膜曝气膜生物反应器（membraneaerated biofilm reactor，MABR）和SBBR等。厌氧序批式生物膜反应器（anaerobic sequencing batch biofilm reactor，AnSBBR）作为SBBR 的变型工艺，能够提供Anammox 生存的良好环境，且具有更高的抗冲击负荷能力和更高的生物浓度，进而更加适合Anammox 的生长。由于AnAOB 的低生长速率，启动阶段尤为困难。为了快速启动Anammox，研究人员尝试过包括厌氧菌污泥、消化污泥、厌氧污泥和厌氧颗粒污泥等不同类型接种污泥。由于好氧活性污泥是污水处理厂容易获得的方便廉价的污泥来源，若能作为AnSBBR 启动Anammox 的接种污泥，将会大大拓展Anammox 在低浓度污水主流处理的工程应用领域。

为此，本研究中通过接种城市污水处理厂普通好氧活性污泥，以聚氨酯泡沫海绵作为填料，建立AnSBBR，并研究其对Anammox的富集效能与脱氮性能。研究结果将有助于对Anammox 快速运行启动一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 实验装置及运行

实验装置简图如图1 所示。AnSBBR 反应器由有机玻璃组成，内径为32cm，高度为30cm，有效容积为5L，填充载体是由聚氨酯制成的立方体海绵（2.5cm×2.5cm×2.5cm）（大连宇都，中国），载体比表面积≥23.3m/g，孔隙率＞95%，堆积密度约为8000n/m。载体的填充率约为50%。AnSBBR 加盖保持密封，并在反应器中通入氮气（99.9%纯度），以保证严格厌氧环境。AnSBBR 反应器内部通过磁力搅拌器进行搅拌混合，运行温度保持在30℃。

图1 AnSBBR反应器

1.2 接种污泥与模拟废水

污泥取自山西省晋中污水处理厂的SBR 反应池的活性污泥（MLVSS 为5.5g/L）。将污泥用去离子水洗涤3次后接种到反应器中。

采用的人工配水方式，进水以NHCl 和NaNO为AnAOB 提供NH-N 和NO-N 源，进水基质的浓度按理论Anammox 配比，以NaHCO（0.4mg/L）作为无机碳源，同时投加一些微量元素，如CaCl·2HO（0.18g/L）、KHPO（0.0272g/L） 和MgSO·7HO（0.3g/L）。

1.3 实验运行

启动阶段无添加碳源，以活性污泥为接种污泥，共运行168 天，分为5 个阶段，进水水质及运行参数如表1 所示。表1 中TN表示进水总氮，DO表示进水溶解氧，HRT表示水力停留时间。

表1 AnSBBR运行启动参数

1.4 化学分析

用便携式pH/Oxi 3420分析仪（WTW 3420，德国）监测DO、氧化还原电位（ORP）、pH 和温度。 COD、NH-N、NO-N 和NO-N 用HACH Lange快速试剂盒（美国HACH公司）测定。

1.5 扫描电镜

在进行SEM观察之前，将生物膜样品在4 ℃下固定在2.5%戊二醛（pH = 6.8）中约1.5 h。随后，将样品用磷酸盐缓冲溶液（0.1mol/L）洗涤3次，然后在分次水-乙醇溶液（50%、70%、80%、90%和100%）中脱水3次，然后用100%异戊基乙酸盐洗涤，并在室温下干燥。最后，将脱水样品镀金，并通过扫描电子显微镜-能量色散光谱法（SEM-EDS）（日本JSM-7001F）进行分析。

1.6 微生物群落分析

在不同时期（第1 天、第47 天、第90 天和第168天）从反应器中取出填料，进行破碎，并通过DNA 试剂盒（美国，Omega）对样品进行DNA 提取。 16SrRNA 的V3-V4 区引物为341F （5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′） 和 805R （5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）。最后交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行Illumina 高通量测序。

2 结果与讨论

2.1 Anammox工艺启动及稳定运行

AnSBBR 的启动过程如图2 所示。根据对NH-N 的去除效果，启动过程可分为细胞裂解阶段、滞后阶段、过渡阶段和活性提升阶段。阶段划分类似于以前文献中的阶段划分。

图2 启动过程总氮去除性能

Anammox 工艺启动初期为细胞裂解阶段（污泥转化阶段，第1～11 天）。好氧活性污泥接种在AnSBBR装置运行Anammox工艺后，首先以内源反硝化为主。由于环境条件的变化，接种污泥中的非适应细菌容易发生细胞裂解。为了降低出水NH-N浓度，采用提高DO（3～4mg/L）的方式，降低高氨氮对Anammox的不利影响。随后进入滞后期（第12～21天）。在此阶段，出水NH-N 和NO-N 浓度在低氮负荷率（NLR）时呈逐渐降低的趋势。在这一阶段没有观察到NH-N 和NO-N 的同步去除现象。在过渡阶段（第22～60天），进水DO从3.46mg/L降低到0.1mg/L 以下，从第22 天开始，出水NH-N逐渐降低，脱氮率开始提高到60%以上，但反应器内的生物载体仍然是棕色生物膜，没有观察到红色。第40天开始，NH-N 和NO-N 开始同步下降，同时，AnSBBR中棕红色生物载体逐渐开始显现。当氮负荷率NLR 为0.017kg/(m·d)时，氮去除率（NRE）和氨氮去除率（ARE）最高，分别达到89%和95%以上。据报道，活性污泥中首次出现Anammox活性的时间至少需要60天。

在第61～102 天，Anammox 活性显著升高，NH-N 和NO-N 的同步去除显著。而其他研究相比，本研究以好氧活性污泥为接种污泥，采用AnSBBR 反应器仅用40 天成功地启动了Anammox。随后的运行，HRT从36 h缩短至24 h，系统仍保持较高的总氮去除率（＞80%），说明系统Anammox反应具有较高的稳定性。

在阶段Ⅴ（第102～168 天），观察到该阶段的总氮去除率和氨氮去除率都达到了90%以上，系统在缩短HRT 增加进水氮负荷的情况下，Anammox 系统仍表现出优异的脱氮性能，说明本系统的Anammox 工艺具有较高的稳定性和理想的脱氮能力。

2.2 化学计量分析

在实验过程中，化学计量比的变化如图3 所示。化学计量比可以反映反应过程中脱氮途径。根据Anammox反应方程式，理论ΔNO-N/ΔNH-N和ΔNO-N/ΔNH-N 为1.32 和0.26。在阶段Ⅰ～Ⅱ，ΔNO-N/ΔNH-N波动较大，为3～10，表明此阶段几乎没有AnAOB，系统DO很高，主要以硝化反应为主。阶段Ⅲ～Ⅳ，ΔNO-N/ΔNH-N比值接近理论Anammox 反应比值1.32，并且保持稳定，说明系统存在开始出现了Anammox 效果。而ΔNO-N/Δ NH-N 的比值也在逐渐向0.26 接近，说明Anammox 反应逐渐在系统中占据主导。在阶段Ⅴ，当反应器置于厌氧环境中运行，ΔNO-N/ΔNH-N的比例低于理论值0.26，可能是刚转入厌氧环境后系统中存在较为明显的反硝化作用，因反硝化菌具有比AnAOB 更强的适应性。后期因可能存在生物膜内源反硝化，故ΔNO-N/ΔNH-N的比值长期低于0.26。

图3 化学计量比变化

2.3 生物膜特性分析

图4为启动90天生物膜光学和扫描照片。从图4(a)和(b)能观察到生物膜表面的胞外聚合物结构，内外附着的黏性结构有所差别，颜色表现为生物载体外层为棕色，内层为红棕色。相较于图4(a)的生物膜表面，可以发现，内部生物膜的表面结构更为致密，颜色更深更红，更为贴近AnAOB 的铁红色在内部的生物膜中富集。填料的多孔结构有利于微生物附着和营养物质在内部传质。因填料内部受气流与水流的剪切力影响较小，且受浓度波动较小，微生物生长环境较稳定，并且在生物膜内存在一定的DO浓度梯度因此具有相对外部更稳定的厌氧环境，厌氧微生物更易生长。因此，填料内部的微生物量和群落结构更为稳定，且出现类似颗粒污泥的团状污泥聚集体。这也说明了采用填充了PU 的AnSBBR 有利于AnAOB 的高效富集和活性发挥。

图4 第90 天生物膜光学照片与扫描电镜图

2.4 厌氧氨氧化启动比较

接种污泥的类型对Anammox 的启动和微生物富集至关重要。在本研究中，从AnSBBR 中的普通活性污泥中仅用40 天成功启动了Anammox，而其他研究的启动时间高达47～90天（表2）。本研究的操作策略包括逐渐降低溶解氧，控制低溶解氧浓度及无溶解氧，结果这种操作启动方式更有利于Anammox 的快速启动完成，启动时间大大缩短。在阶段Ⅱ（第40～60天），总脱氮效率均超过70%，脱氮负荷率稳定在0.013kg/(m·d)以上，标志着Anammox 工艺的成功启动。在60 天之后，系统脱氮率逐渐上升至95%以上，并且保持稳定，说明生物膜厌氧氨氧化系统具有较高的稳定性和高效的脱氮性能。相较于活性污泥和颗粒污泥，生物膜具有良好的生物持留能力，有利于富集AnAOB 的持留和洗出其他类型的微生物。同时，生物膜的形成无需长时间驯化，运行操作较简单，没有污泥沉降之虑，适合与大规模广泛应用。

表2 本研究与其他厌氧氨氧化工艺启动比较

2.5 微生物分析

2.5.1 微生物多样性分析

微生物群落的多样性特征如表3所示。物种丰富度用Chaol和ACE表示，物种多样性用Shannon和Simpson 指数表示。第1 天、第47 天到第90 天，ACE 和Chaol 的增加表明物种丰富度增加，而Simpson 指数的降低则表明物种多样性的增加，表明启动生物膜厌氧氨氧化的过程是一个生物多样性趋于复杂的过程。在阶段Ⅴ（第168 天），ACE 和Chaol 指数的降低表明物种丰度降低，而Shannon的增加和Simpson 指数的降低则表明物种多样性的提高。说明在后期，生物膜厌氧氨氧化系统的微生物群落更加多样化。

表3 微生物群落多样性指数

2.5.2 微生物群落构成

微生物群落在长期启动多样性在门和属水平如图5 所示。变形菌门、拟杆菌门和酸性细菌门在所有生物载体中占优势[图5(a)]，这与Qin 等的结果相似。在第47 天和第90 天，变形杆菌门的比例从30.2%上升到79.1%，类杆菌门和酸性细菌门的比例从30.6% 和13.7%逐渐下降到3.0%和6.9%，说明Anammox 启动过程门水平的优势微生物群落发生改变。而对于包含AnAOB 的门，在阶段Ⅴ（第168天）最高达到了21.6%，相对地，此阶段的Anammox效果最明显。

不同的启动方式对AnAOB 的优势菌属具有重要影响。Wu 等在CAMBR 中接种硝化反硝化和厌氧颗粒污泥，Wang 等在SBR 和MBR 中接种活性污泥，优势AnAOB 属为。Zheng 等在填充了生物膜的SNAD 工艺中以活性污泥启动，发现成为了优势菌属。在本研究，和是检测到的AnAOB 优势菌属[图5(b)]。AnAOB 的相对丰度从第1 天的0.01%增加到第90 天的1.3%，成为优势功能菌，表明Anammox工艺启动和富集成功。在阶段Ⅴ（第168天），AnAOB相对丰度最高达到了12%。此外，在第1 天、第47 天和第90 天样品中，的相对丰度都高于，这可能是由于系统中的亚硝酸盐浓度较低时，以及在生物载体中，a 对基质的亲和力更强。在第168天样品中，成为了优势AnAOB，推测原因为在纯厌氧环境下具有更强的适应性。r是47 天的优势异养反硝化细菌属，相对丰度为24.1%，但在第90天和第168天时仅为1.9%和0.1%。门酸杆菌的其他核心属如和GP4 在长期运行过程中略有减少。说明在启动过程中，AnAOB 成为优势菌群的同时，各反硝化菌的相对丰度在减少，但多样性明显增加。

图5 AnSBBR的门和属的相对丰度

3 结论

（1）以活性污泥作为接种污泥，AnSBBR系统经过40 天成功启动厌氧氨氧化，60 天运行系统脱氮率大于70%。

（2）生物载体生物膜内部呈现较红颜色，SEM显示内部团状的胞外聚合物可能为AnAOB 提供良好的生长微环境。

（3）在启动过程中，AnAOB 的相对丰度由最初的0.1%提高到12%，且发现优势AnAOB 菌属由向转变。