HPLC法同时测定忍冬藤配方颗粒中的3种成分

李志娇 巩长芹 李学红 张晓博

（1.临沂市检验检测中心 山东 临沂 276001；2.齐鲁制药有限公司）

1 前言

忍冬藤是忍冬科植物忍冬（Lonicera japora'ca Thunb.）的干燥茎枝，于秋、冬采割晒干，味甘、性寒，归肺、胃经，具有疏风、通络、解毒、清热之功效，常用于治疗温病发热、风湿热痹、痈肿疮疡、热毒血痢等病症[1]，临床证实其对风湿肝病也有一定疗效[2]。忍冬藤配方颗粒由忍冬藤饮片经提取、浓缩、干燥而成，具有便于携带、免煎易服用、方便贮藏等优点[3]。忍冬藤的主要活性成分为环烯醚萜苷类（咖啡酸、绿原酸）和有机酸类（马钱苷）[4]。本文采用高效液相色谱法测定忍冬藤配方颗粒中绿原酸、咖啡酸、马钱苷的含量，以期为忍冬藤配方颗粒的质量控制提供科学依据。

2 仪器与试药

2.1 仪器

高效液相色谱仪（Waters 2695，美国沃特世公司）；十万分之一电子分析天平（XS205型，瑞士METTLER TOLEDO公司）；数控超声波清洗器（KQ-300DE型，昆山市超声仪器有限公司）；紫外—可见分光光度计（UV-2401pc）；超纯水机（Milli-Q，法国默克）。

2.2 试药

绿原酸（批号：110753-202018，含量96.1%）、咖啡酸（批号：110885-201703，含量99.7%）、马钱苷对照品（批号：111640-201808，含量99.0%）（中国食品药品检定研究院）；忍冬藤配方颗粒（山东宏济堂制药集团股份有限公司3批次：2007001、2007002、2007003；青州尧王制药有限公司3批次：522008085S、522008086S、522008087S）；甲醇、乙腈（色谱纯，Merck KGaA公司）；磷酸为色谱纯；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

3 方法与结果

3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）—0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～15 min，A 10%；15～20 min，A 10%→14%；20～45 min，A 14%→20%，45～50 min，A20%）；检测波长：236 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL。

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液配制

精密称定绿原酸对照品10.39 mg、咖啡酸对照品10.85 mg、马钱苷对照品10.33 mg，分别置于100 mL棕色量瓶中；加入50%甲醇溶解，并加入50%甲醇，稀释至刻度；摇匀，备用。临用时，分别量取各对照品储备液2 mL、1 mL、20 mL，置于同一25 mL棕色容量瓶中；加入50%甲醇，稀释至刻度；摇匀，制成混合对照品溶液。

3.2.2 供试品溶液配制

取忍冬藤配方颗粒，研细；精密称定0.2 g，置于锥形瓶中；精密加入50%乙醇25 mL，称定重量；超声提取30 min，放冷，用50%乙醇补足减失重量；摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

3.2.3 阴性溶液配制

按忍冬藤配方颗粒的处方要求，加入适量辅料，按供试品制备方法，制备成阴性溶液。

3.3 干扰试验

分别取对照品、样品溶液及阴性溶液，按“3.1”项的色谱条件，进样，分析。结果显示，在样品色谱图中，呈现出与对照品保留时间一致的特征峰，绿原酸、咖啡酸、马钱苷的保留时间分别为12.17 min、16.88 min、20.36 min，阴性溶液未呈现与对照品保留时间一致的特征峰，表明阴性样品对所测组分无干扰，理论塔板数均＞5 000，3种成分的分离度均＞2.0，详见图1。

图1 忍冬藤配方颗粒HPLC图

3.4 线性关系

取混合对照品溶液1、2、4、5、8、10 μL，按“3.1”项的色谱条件进行测定，记录液相色谱图。以进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，建立回归方程，结果见表1。

表1 回归方程及其范围

3.5 精密度

取“3.2”项的对照品溶液，按照“3.1”项的色谱条件，连续进样6次，进样量为5 μL，记录峰面积。结果显示，绿原酸、咖啡酸、马钱苷峰面积的平均值分别为125 965、119 563、1 260 337，RSD分别为0.43%、0.49%、0.26%，表明仪器的精密度较好。

3.6 重复性

分别精密称取同一批次样品6份 （批号：2007001），按“3.2”项的制备方法制备供试品溶液，按“3.1”项的色谱条件进样，进样量为5 μL。结果显示，绿原酸、咖啡酸、马钱苷峰面积的平均值分别为429 571、166 138、1 186 187；平均含量分别为3.36、0.74、9.48 mg/g；RSD为0.11%、0.50%、0.18%。表明该方法的重复性良好，可用于检验。

3.7 稳定性

参考陈娟等[5]的稳定性试验，取忍冬藤配方颗粒（批号：2007001）溶液，置于室温中；分别在配制后0、2、4、6、8、10、12、24 h，进样分析，进样量为5 μL，记录峰面积。结果显示，绿原酸、咖啡酸、马钱苷峰面积的平均值分别为125 135、118 776、1 245 638；RSD分别为0.66%、0.67%、1.10%。表明供试品溶液在24 h内比较稳定。

3.8 加样回收

取已知含量的同一批忍冬藤配方颗粒6份（批号：2007001），精密称取0.1 g，置于具塞锥形瓶中；每份精密加入对照品溶液，按“3.2”项的制备方法制备供试品溶液，按“3.1”项的色谱条件进样，进样量为5 μL，结果见表2。

表2 加样回收结果（n=6）

3.9 含量测定

取6批忍冬藤配方颗粒，按“3.2.2”项的制备方法制备样品溶液，按“3.1”项的色谱条件进样，进样量5 μL，记录各峰面积，按外标法计算，结果见表3。

表3 含量测定结果表（n=2）

4 讨论

4.1 波长的选择

本文对绿原酸、咖啡酸、马钱苷进行紫外吸收光谱扫描，得到绿原酸在327 nm、咖啡酸在322 nm、马钱苷在236 nm处，各有最大吸收，但在236 nm处，均有明显吸收，故选择236 nm作为测定波长。

4.2 流动相的选择

本文参考《中国药典》2020年版一部中“忍冬藤”和《中国药典》2015年版一部中“蒲公英”含量测定的流动相[6-7]，流动相有乙腈—0.1%磷酸溶液梯度洗脱；乙腈—0.4%磷酸溶液、甲醇—磷酸盐缓冲液等度比例，通过试验发现，以乙腈—0.4%磷酸梯度洗脱为流动相，峰形最好，3种成分的分离度高，阴性样品无干扰。

4.3 提取溶剂方法的选择

胥爱丽等[3]、姚宣等[8]的试验考察了以50%甲醇、50%乙醇作为提取溶剂，加入20 mL、25 mL、50 mL提取倍量对检测的影响，结果显示，以25 mL 50%甲醇作为提取溶剂，提取率最高；考察了超声20 min、30 min、45 min、60 min对检测的影响，结果显示，加入25 mL 50%甲醇、超声处理30 min与60 min，测得的结果相差很小，故本文选择加入25 mL 50%甲醇、超声处理30 min，作为提取方法，省时简便。