短期碱胁迫条件下燕麦穗组织的蛋白组学解析

赵 洲，刘景辉 ，萨如拉，周玉雷

(1.赤峰学院化学与生命科学学院,内蒙古赤峰 024000;2.内蒙古农业大学杂粮产业协同创新中心，内蒙古呼和浩特 010019)

燕麦(L.,2n=6x=42) 属禾本科一年生草本植物，是全球种植的第六大禾谷类作物。其籽粒富含蛋白质、不饱和脂肪酸、可溶性膳食纤维、B族维生素、β-葡聚糖以及燕麦蒽酰胺(avenanthramides，AVAs)等，在抗炎、抗增生、治疗糖尿病以及心血管治疗方面都有特殊疗效，是优良保健食品。燕麦具有很好的耐盐碱特性，是改良盐碱化土壤的优良作物。

盐碱胁迫会抑制作物的生长、发育，最终影响作物产量。研究发现，盐碱对水稻穗部性状(穗长、穗重、穗粒数、籽粒饱满度等)及灌浆的胁迫程度与盐碱浓度密切相关；品种间存在明显差异，轻度盐碱胁迫可促进抗性品种提高结实率，却明显抑制敏感品种。盐碱胁迫对燕麦的产量和籽粒品质有明显的抑制效应，抑制程度因品种而异；随着盐碱胁迫加重，燕麦产量呈递减趋势，主要因为千粒重与穗粒数的降低。盐碱胁迫对燕麦籽粒成分的影响存在品种间差异。在遭受逆境胁迫过程中，穗在协调组织的抗逆过程中发挥着重要作用。在干旱胁迫下，抗旱小麦品种穗中苯丙烷类代谢途径加强，能维持很好的细胞膜完整性并保持足够的水分；盐碱胁迫下水稻穗中的部分蛋白上调表达，如：渗透调节蛋白、抗逆相关蛋白、促进RNA稳定及蛋白合成类蛋白、WD-repeat信号类蛋白、Nucleoside diphosphate kinase(NDPK)、参与脂肪酸合成的enoyl-ACP reductase(ENR)、ATP合成以及ROS清除类蛋白等。有关燕麦穗的抗盐碱机理研究尚未见报道。本研究在燕麦抽穗期进行短期碱胁迫处理，运用Label Free蛋白组学技术对穗组织开展相关研究，以期明确碱胁迫下燕麦穗组织在蛋白水平上的响应机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料种植及处理

以耐盐碱品种 Vao-9(父母本为99VB-84-1和99VB-22-2)以及盐碱敏感品种 Xin-17作为材料。挑选完整、大小均匀的种子，于0.1% HgCl中消毒8 min，无菌蒸馏水清洗3次，自然晾干。种植于盛满蛭石的盆中(直径25 cm,高30 cm)，温室定期浇灌Hoagland溶液及蒸馏水。

抽穗期(约50%植株抽穗)进行盐碱胁迫处理。碱性盐 NaHCO和NaCO按等摩尔比混合，设置2个浓度处理，分别为0 mmol·L(对照，pH 7.0)和100 mmol·L(pH 9.82),重复3次。处理6 d后，采集不同处理的穗,进行Label Free 蛋白组分析。

1.2 蛋白提取及分析

取1.1中采集的穗适量在液氮中充分磨碎，加入5倍体积的TCA/丙酮(1∶9)，置于-20 ℃沉淀，4 ℃、6 000 r·min离心1 h，收集沉淀；用预冷丙酮洗涤3次，干燥沉淀。采用BCA法进行蛋白质定量。并通过SDS-PAGE电泳进行检测分析。

按被测蛋白量的 1/50的比例加入胰蛋白酶，37 ℃过夜消化；12 000 ×g 离心 20 min，收集肽段沉淀。采用HPLC液相系统Easy nLC进行蛋白分离。缓冲液A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为84%)。色谱柱以95%的A液平衡，样品由自动进样器上样，经过分析柱分离，流速为300 nL·min。

1.3 蛋白质谱鉴定及分析

样品经色谱分离后用质谱仪进行质谱分析。分析时长为120 min ，检测方式为正离子，母离子扫描范围300～1 800 m·z，一级质谱分辨率为70 000(200 m·z)，AGC(Automatic gain control)设为1e6，Maximum IT设为50 ms，Dynamic exclusion 设定为60.0 s。质谱分析原始数据采用MaxQuant软件(版本号1.5.3.17)进行查库鉴定及定量分析。蛋白及肽段False discovery rate(FDR)小于等于0.01。表达差异倍数大于 2.0 (上、下调)且value 小于 0.05的蛋白质视为差异表达蛋白质(different expressed proteins，DEPs)。

1.4 蛋白功能注释、富集及聚类分析

利用序列比对工具NCBI BLAST+(ncbi-blast-2.2.28+-win32.exe)对目标蛋白质集合进行GO(gene ontology)注释。为提高注释效率，通过InterProScan搜索EBI数据库中与目标蛋白质匹配的保守基序，并将相关的功能信息注释给目标蛋白质序列；运行ANNEX对注释信息进一步补充，并在不同的GO类别之间建立联系，以提高注释的准确性。

在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库中，利用KAAS(KEGG Automatic Annotation Server) 软件，对目标蛋白质集合进行KEGG通路注释,将目标蛋白质序列进行KO(KEGG Ontology)归类，并根据KO归类自动获取目标蛋白质序列参与的通路信息。

在对目标蛋白质集合进行GO注释或KEGG通路注释的富集分析时，通过Fisher精确检验，比较各个GO分类或KEGG通路在目标蛋白质集合和总体蛋白质集合中的分布情况，评价某个GO term或KEGG通路蛋白质富集度的显著性水平。

对目标蛋白质集合的定量信息进行归一化处理[归一化到(-1,1)区间]。使用Cluster 3.0软件同时对样品和蛋白质的表达量两个维度进行分类。使用Java Treeview软件生成层次聚类 热图。

2 结果与分析

2.1 碱胁迫对燕麦生长的影响

碱胁迫6 d后，抗性品种Vao-9的胁迫组(Vao-9T)与对照组(Vao-9CK)之间表型没有差异。而敏感品种Xin-17的处理组(Xin-17T)较对照组(Xin-17CK)株高明显变矮，老叶开始黄化并出现萎蔫，且穗长明显较短，小穗数明显减少。Vao-9T与Vao-9CK间穗含水量没有显著差异；Xin-17T较Xin-17CK的穗含水量显著降低(<0.01)(图1)。这说明碱胁迫对燕麦盐碱敏感品种生长有明显抑制作用，对抗盐碱品种影响较小。

2.2 碱胁迫对燕麦穗组织蛋白组分的影响

经过分离、鉴定，在Vao-9CK中获得60 446个肽谱图，Vao-9T中获得61 883个肽谱图，对其分别鉴定得到2 682、2 806个蛋白；在Xin-17CK及Xin-17T中分别获得10 320、9 933个肽谱图，最终分别获得2 783、2 753个蛋白；四个处理组中检测得到2 306个相同蛋白(图2)。经过进一步分析发现，Vao-9T与Vao-9CK比较，共发现50个差异表达蛋白28个上调表达，22个下调表达；Xin-17T与Xin-17CK比较，有24个差异表达蛋白上调表达，22个下调表达；Xin-17T与Vao-9T比较，发现82个差异表达蛋白，其中41个上调表达，41个下调表达(表1)。

表1 上调及下调表达的差异蛋白数Table 1 Number of up-and down-regulated DEPs

Vao-9T：Vao-9碱胁迫;Vao-9CK：Vao-9对照；Xin-17T：Xin-17碱胁迫；Xin-17CK：Xin-17对照。下同。图柱上不同字母表示差异显著(P≤0.01)。

图2 不同处理中获得蛋白的Venn图Fig.2 Venn figure of proteins under different treatments

2.3 差异表达蛋白GO和KEGG富集分析

对差异表达蛋白进行GO富集分析，发现两个品种间碱处理组与其对照中出现的差异表达蛋白类型明显不同。在抗性品种Vao-9中，发生差异表达的蛋白主要是DNA聚合酶组分蛋白以及转录因子组分蛋白(图3)，其对应的生物学功能主要与抗逆、DNA修复、多糖代谢、乙醇合成等有关；在敏感品种Xin-17中，发生差异表达的蛋白主要与内质网组分、细胞骨架组分以及膜结构组分有关(图4)，其主要与糖代谢有关。这说明对于碱胁迫，抗性品种的穗组织表现为主动抵御，而敏感品种的穗组织则表现为被动的能量消耗。

富集条目为top 10条目；柱形图右侧值分别为P值和富集指数；P:生物过程；F:分子功能；C:细胞成分。下同。

图4 Xin-17T/Xin-17CK处理组GO富集分析Fig.4 GO enrichment in Xin-17T/Xin-17CK treatment group

进一步的KEGG富集分析(图5)发现，在对照条件下，两个品种之间几乎没有富集到差异表达途径，而碱胁迫后，二者出现较多的差异表达途径，主要包括信号感应及传递(Quorum sensing、MAPK signaling pathway-plant)、甘油脂类代谢、鞘糖脂合成、赖氨酸降解、细胞周期、半乳糖代谢、核苷酸切除修复、吲哚碱合成等。通过富集分析，两个品种中均发现大量的“黄酮、类黄酮合成途径”相关蛋白；敏感品种的差异蛋白多分布于“缬氨酸-亮氨酸异亮氨酸降解途径”，而抗性品种的差异蛋白多集中在“核苷酸切除修复途径”。

图5 KEGG代谢途径富集分析Fig.5 KEGG enrichment of metabolism pathway

对Vao-9T、Vao-9CK及Xin-17T、Xin-17CK两个处理组中获得的主要差异蛋白进一步分析显示，这些差异蛋白功能集中在蛋白合成以及加工、光合作用、糖代谢、次生代谢、细胞组分合成、信号传递以及抗逆过程(图6-7，表2-3)。

图6 Vao-9T/Vao-9CK处理组差异蛋白热图Fig.6 Vao-9T/Vao-9CK treatment group heat map

在这些蛋白中，核糖体组分I1H5D5及与信号、抗逆相关的I1HPB2、Q40237、Q9M4C7，在两个品种中都下调表达。参与次生代谢合成过程的Q9ZTU0(Caffeic acid O-methyltransferase)在抗性品种Vao-9中上调表达3.0倍，而在敏感品种Xin-17中则下调表达0.5倍(表2-3)；同样，其他参与次生代谢的差异蛋白在Vao-9中均上调表达(W5D5N4，F2D5L5)，而在Xin-17中则下调表达(I1IBR5，I1IV07)(表2-3)。I1HWE6(UTP--glucose-1-phosphate uridylyltransferase)参与UDP-葡萄糖代谢过程，在Xin-17中上调表达2.2倍，而在Vao-9中则下调表达0.4倍；其他参与糖代谢的多个蛋白在Xin-17中也发生上调表达，而在Vao-9中则没有差异表达。

图7 Xin-17T/Xin-17CK处理组差异蛋白热图Fig.7 Xin-17T/Xin-17CK treatment group heat map

表2 Vao-9T/Vao-9CK处理组主要差异蛋白分析Table 2 Main DEPs in Vao-9T/Vao-9CK treatment group

3 讨 论

在盐碱胁迫下，植物糖代谢途径是最容易受到影响的代谢途径之一。相关研究发现，在盐碱胁迫下，燕麦叶片糖代谢途径中出现大量的差异表达蛋白；抗性品种燕麦Vao-9遭受盐胁迫后，不少糖代谢相关的酶出现下调表达；在碱胁迫下，抗性品种燕麦Vao-9根部不少糖代谢途径相关的蛋白都下调表达，而地上组织中相关酶类却出现显著的上调表达。本研究发现，碱胁迫处理6 d后，两个品种穗组织中糖代谢出现大量的差异表达蛋白，特别是在Xin-17中更为明显，这与上述文献结果一致。同时，两个不同抗性品种中糖代谢相关的差异蛋白也表现出明显的差异，表现为：抗性品种中差异表达蛋白相对较少，且以下调表达为主(表2)，而在敏感品种Xin-17中，则出现较多的差异表达蛋白，且多数为显著上调表达(表3)，如：参与多糖水解的酶Q42518、N1NSX3、N1NUT2、N1NV60，参与生物能量转化的A0A1D6D1Q3、I1HWE6等，这些蛋白含量增加有助于增强燕麦的抗逆，同时也说明敏感品种Xin-17对碱胁迫的反应主要是一个消耗能量、被动抵御的过程，这与抗性品种Vao-9的表现截然相反。

表3 Xin-17T/Xin-17CK处理组主要差异蛋白分析Table 3 Main DEPs in Xin-17T/Xin-17CK treatment group

在盐碱胁迫下，蛋白合成、加工等过程也是容易遭受影响的重要代谢过程。在不少植物的相关研究中，均发现此类现象，如：在碱胁迫下，小麦老叶中大量的核糖体组分蛋白显著下调表达，而蛋白酶和核糖核酸酶却显著上升表达；短期碱胁迫后，抗性品种燕麦Vao-9幼苗根中不少核糖体组分蛋白上调表达，而地上部分没有检测到明显的变化。在本研究中，比较抗性品种与敏感品种的穗组织中蛋白在短期的碱胁迫后变化，发现在抗性品种Vao-9穗中，出现很多差异表达蛋白参与蛋白质合成及加工过程，其中不少出现上调表达，包括核糖体组分(A0A0Q3JFN1)及蛋白修饰加工相关蛋白(F2DWA3、M7Z458、I1HVG4)；而在敏感品种Xin-17的穗组织中，只检测到一个差异核糖体组分蛋白，且为下调表达(I1H5D5)。这进一步显示两个品种在抗碱胁迫过程中的明显差异，前者为积极的抵御，后者表现为被动消耗。

研究发现，在盐碱胁迫过程中，谷胱甘肽代谢途径中的一些酶类参与抗逆过程。同时，在碱胁迫下燕麦中检测到大量抗逆相关的蛋白，如：次生代谢物合成相关蛋白、PRs蛋白等。本试验中，盐碱胁迫下，抗性品种Vao-9穗中次生代谢合成酶类显著上调表达(W5D5N4、F2D5L5、Q9ZTU0)而敏感品种Xin-17中则显著下调表达(I1IBR5、Q9ZTU0)；其次Vao-9穗中的谷胱甘肽代谢过程的几个酶类也显著上调表达(I1HUX2、K7AFN0)，而敏感品种Xin-17中却未检测到；敏感品种中两个PRs类抗逆蛋白(P50697、M5AKY4)显著上调表达，这也是两个品种之间的主要差异。这些差异表达蛋白可用于区分与筛选燕麦抗逆与敏感品种。

利用蛋白组学技术开展非模式生物的抗逆胁迫过程研究，具有独特的技术优势，能从复杂的宏观水平对参与数个代谢途径的大量蛋白开展定性、定量研究。由于目前的一些技术问题、蛋白数据库更新问题，也会导致不少冗余数据的产生。而利用蛋白组学技术研究燕麦响应盐碱胁迫的机制、筛选抗性燕麦品种有重要的理论及现实意义。本研究中，在遭受碱短期胁迫后，燕麦敏感品种与抗性品种穗组织中均出现大量的差异表达蛋白参与到次生代谢过程中，如：黄酮、类黄酮的合成等；二者间也表现出明显的差异，特别是在糖代谢过程、蛋白合成过程以及抗逆等。在碱胁迫下，抗性品种穗组织中与蛋白合成有关过程加强，而敏感品种则为多糖类的降解、能量的消耗；抗性品种通过增加次生代谢、谷胱甘肽代谢等抵御胁迫，而敏感品种则表现为PRs类蛋白的大量合成。