高氮与低氮处理对不同氮效率小麦根系及相关生理特性的影响

海闯北，彭超军，李 艳，齐学礼，方宇辉，华 夏，许为钢

(1.河南农业大学农学院，河南郑州 450046；2.河南省农业科学院作物分子育种研究院/河南省小麦生物学重点实验室/河南省麦类种质资源创新与改良重点实验室,河南郑州 450002)

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，氮肥的施用为提高小麦产量发挥了重要作用。但许多国家在小麦生产中存在氮肥过度施用、氮肥利用率偏低的问题，而且氮肥的过度施用也造成面源污染[1]。因此，研究不同氮素水平对小麦形态特性和相关生理特性的影响，可为节肥高产品种的遗传改良工作提供帮助[2-4]。

土壤中氮状态的改变会引起植物的动态反映，优化氮素的获取，以达到调节植物的整体生长[5]。根系对氮素的吸收为光合作用提供了不可缺少的氮源[6]。根系性状和根系构型对植物氮素高效利用、植物健康生长和生产力的高低有重要的影响[7-8]。施氮水平会对根系形态产生很大的影响，比如根的长度、根尖数等[9-10]。因此，研究高、低氮条件下小麦根系性状的变化差异，特别是不同氮素利用效率材料之间的差异，有助于进一步了解根系对氮素吸收能力的影响以及发掘优异的氮高效基因型资源[11]。

本试验拟研究高氮和低氮处理对氮高效小麦品种和氮低效小麦品种根系活力、高亲和硝酸盐转运蛋白基因表达模式、以及不同时期氮代谢关键酶活性和氮素积累量的影响，以期为氮高效小麦品种的氮利用效率特性改良提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为3个氮高效小麦品种(周麦32、郑麦1860和郑麦7698)和3个氮低效小麦品种(R93127、豫麦61和小偃6号)，均由本实验室鉴定并保存。本实验室2019-2020年度对这6个品种的氮素利用效率指数的鉴定结果：周麦32为2.104，郑麦1860为2.959，郑麦7698为2.967，R93127为0.261，豫麦61为0.328，小偃6号为0.184；2020-2021年度对这6个品种的氮素利用效率指数的鉴定结果：周麦32为1.306，郑麦1860为1.375，郑麦7698为1.423，R93127为 0.497，豫麦61为0.345，小偃6号为0.413。

1.2 水培试验

将在光照培养箱(温度设定为白天21±1 ℃，夜间18±1 ℃；光照周期为16 h光照/8 h黑暗；光强为190～200 μmol·m-2·s-1)中培养至两叶一心的材料移栽到装有10 L培养液的生长箱内，并设高氮(5 mmol·L-1NH4NO3)和低氮 (0.5 mmol·L-1NH4NO3)两个处理，两个处理的其他元素含量相同，具体为1 mmol·L-1K2SO4、0.5 mmol·L-1KH2PO、5 mmol·L-1CaCl2、1 mmol·L-1MgSO4、0.1 mmol·L-1FeNaEDTA、0.001 mmol·L-1MnSO4·7H2O、0.000 5 mmol·L-1CuSO4·5H2O、0.001 mmol·L-1ZnSO4·7H2O、0.001 mmol·L-1H3BO3以及 0.000 35 mmol·L-1Na2MoO4。生长箱培养液液面置一泡沫板(规格为6×7孔)，每孔植苗1株，放置于培养间，环境条件设定为白天温度 18 ℃，晚上温度8.5 ℃；光照14 h，每3 d换一次培养液，培养28 d后，取材测定。

1.3 田间试验

试验于2019-2021年度在河南省农业科学院现代农业研究开发基地(河南省原阳县桥北乡平原新区，113°40′E，35°00′N，海拔77 m)进行，试验地土壤类型为轻壤土，播种前土壤基础肥力见表1，试验设高氮和低氮两个处理，高氮处理下氮肥(纯N，尿素和磷酸二胺)施用量为239.9 kg·hm-2，其中69.0 kg·hm-2在拔节期作为追肥施入，其余作为基肥施入，磷肥为磷酸二胺(P2O5172.4 kg·hm-2)、钾肥为氯化钾(K2O 45.0 kg·hm-2)，均作为基肥施入。低氮处理下只在磷肥施用中引入氮肥，磷肥和钾肥使用量和方法同高氮处理。试验采用随机区组设计，3次重复，每个材料种植4行，行长2 m，行距23.3 cm，株距3.3 cm。播种时间为每年的10月7号。

表1 土壤基础肥力Table 1 Basic soil fertility

1.4 水培试验测定项目与方法

1.4.1 根形态参数和根系活力的测定

移栽生长箱4周后，高氮和低氮处理每个材料取长势均匀的5株植株，用Epson 2100扫描仪(Epson，日本)扫描后，用根系图像分析软件Win-RHIZO(Regent Instruments,加拿大)测定根长、根表面积、根直径、根体积、根尖数，按照氯化三苯基四氮(TTC)方法测定根系活力[23]。

1.4.2 根系硝酸盐转运蛋白基因表达模式的测定

用MonzolTMReagent(莫纳，苏州)提取植物组织总RNA，用MonScriptTMRTIII All-in-One Mix with dsDNase(莫纳，苏州)合成cDNA。用CFX Connect Real-Time PCR (Bio-Rad)进行荧光定量PCR检测，引物序列、PCR反应体系和反应程序均参考Wang等[24]的方法。用 2-ΔΔCt法[25]计算基因的相对表达量，以小麦GAPDH基因作为内参。

1.5 大田试验测定项目与方法

在各小区选取长势均匀的一行，取中部50 cm的植株作为大田样品，用剪刀除去根系。取样时期与部位分别为：拔节期的茎鞘和叶；开花期的茎鞘、叶和穗；成熟期的茎鞘、叶、籽粒和颖壳。经105℃杀青30 min，70℃烘干24 h至恒重后，测定干重，并采用Vario MICRO cube元素分析仪(Elementar，美国)测定氮含量，每个样品重复测定3次，由干重和氮含量计算植株地上部氮积累量(氮素积累量=干重×氮含量)。分别于齐穗期、开花期和花后15 d取生长一致的小麦植株，取旗叶用于测定硝酸还原酶[26]和谷氨酰胺合成酶[27]的活性。

1.6 数据处理

用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)。

2 结果与分析

2.1 水培条件下苗期根系相关形态及生理参数

由表2可以看出，在高氮和低氮处理下，氮高效品种的根尖数、根长、根体积、根表面积和根活力均显著高于氮低效品种。除氮低效品种的根尖数在低氮处理下略低于高氮处理外，氮高效品种和氮低效品种在低氮处理下的性状表型值均高于高氮处理，特别是根尖数、根体积和根活力的差异比较明显。表明虽然氮高效品种和氮低效品种的根形态和活力对低氮处理具有主动反应，但由于氮高效品种在根形态性状和根系活力上本身就显著优于氮低效品种，对低氮环境的响应更加明显。

表2 高氮和低氮处理对氮高效品种和氮低效品种根形态和根活力的影响Table 2 Effect of high- and low-nitrogen treatments on root morphology and root activity of wheat varieties with different nitrogen use efficiency(NUE)

2.2 水培条件下低氮处理对根系硝酸盐转运蛋白基因的相对表达量的影响

由表3可以看出，低氮处理下三个氮高效品种中硝酸盐转运蛋白基因TaNRT2.1、TaNRT2.2、TaNRT2.3、TaNAR2.1、TaNAR2.2和TaNAR2.3的相对表达量均显著高于三个氮低效品种，其平均值分别是三个氮低效品种平均值的1.93、2.31、2.13、2.27、2.00和3.17倍。这说明氮高效品种对低氮的响应较为强烈，在低氮环境中仍具有较强的氮素转运能力。

表3 低氮处理对不同硝酸盐转运蛋白基因相对表达量的影响Table 3 Effect of low nitrogen treatment on relative expression levels of different nitrate transporter genes

2.3 大田条件下高氮和低氮处理对不同时期小麦旗叶硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的影响

由表4可以看出，高氮和低氮处理下，氮高效品种在齐穗期、开花期和花后15 d的硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性均显著高于氮低效品种；与高氮处理相比，低氮处理下氮高效品种和氮低效品种的硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性在不同时期均有所降低，其中氮高效品种的硝酸还原酶活性在齐穗期、开花期和花后15 d的降低幅度分别为16.17%、11.03%和15.51%，均低于氮低效品种(29.27%、20.66%和20.75%)；氮高效品种的谷氨酰胺合成酶活性在齐穗期、开花期和花后15 d的降低幅度分别为1.99%、10.77%和 6.92%，也均低于氮低效品种(19.89%、15.35%和13.84%)。这表明减氮对氮高效品种的硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性影响较小，而氮低效品种的硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性在高氮和低氮处理下的变化较大，反映出其对氮环境变化的敏感性。

表4 高氮和低氮处理下氮高效品种和氮低效品种旗叶硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的差异Table 4 Comparison of nitrate reductase and glutamine synthetase activity between high nitrogen use efficiency varieties(HNV) and low nitrogen use efficiency varieties(LNV) under high-and low-nitrogen treatments U·g-1

2.4 大田条件下高氮和低氮处理对不同时期植株地上部氮素积累量的影响

从表5可以看出，高氮和低氮处理下，氮高效品种在拔节期、开花期和成熟期的氮素积累量均显著高于氮低效品种；与高氮处理相比，低氮处理下氮高效品种和氮低效品种的氮素积累量在不同时期均有所降低，氮高效品种在拔节期、开花期和成熟期的降低幅度分别为12.62%、22.70%和 6.70%，均低于氮低效品种(24.51%、31.16%和16.56%)。表明氮高效品种的氮素积累量受低氮影响相对较小，对低氮环境具有一定的适应性。

表5 高氮和低氮处理下氮高效品种和氮低效品种中氮素积累量的差异Table 5 Comparison of nitrogen accumulation between high nitrogen use efficiency varieties(HNV) and low nitrogen use efficiency varieties(LNV) under high-and low-nitrogen treatments g

3 讨 论

根系在小麦生长发育中发挥着极其重要的作用，特别是对矿质营养元素吸收与利用方面不可或缺，根系性状和根系构型成为科学家研究提高作物产量、品种抗逆性的重要性状。但是根系构型复杂，且在土体之中，因此研究难度增加[28]。植物根系通过调节其根系形态以及生理特性来适应氮供应水平，以满足自身对氮素的需求[29]。而且这种生理代谢功能上的差异在低氮条件下可自身强化，如根系伸长、根系分支数量增加等[30]。本研究表明，氮高效小麦品种在低氮环境中的根长、根表面积、根直径、根体积、根尖数和根系活力均明显增加，增加幅度大于氮低效品种，表明氮高效品种更适应环境的改变，在低氮条件下，根系形态和活力优于氮低效品种[31-33]。

NRT2基因家族蛋白在低氮条件下对硝态氮的获取发挥着重要的作用，但需要伴侣蛋白NAR2的参与[19,34]。研究发现，TaNRT2.1、TaNRT2.2、TaNRT2.3、TaNAR2.1、TaNAR2.2和TaNAR2.3主要在小麦根部表达[34]，本研究对这几个基因在不同氮素利用效率材料的表达差异进行了研究，发现低氮处理下TaNRT2.1、TaNRT2.2、TaNRT2.3、TaNAR2.1、TaNAR2.2和TaNAR2.3基因均上调表达，且氮高效品种上调幅度远远高于氮低效品种。这进一步从分子水平上解析了不同氮效率小麦品种中氮素吸收利用基因表达差异的代谢基础。

硝酸还原酶是小麦氮素同化的限速酶(诱导酶)，可调节氮的代谢，促进光合碳代谢，在一定的程度上反应了作物对氮肥吸收利用的情况。本研究发现，低氮处理对氮高效品种的硝酸还原酶活性的影响较小，反映出其对低氮环境具有较强的耐受性。此外，本研究还发现，氮高效品种的硝酸还原酶活性在齐穗期、开花期和花后15 d三个生育时期均显著大于氮低效品种，这表明氮高效品种本身具有较强的硝酸盐还原能力，有助于氮素的同化积累。谷氨酰胺合成酶作为小麦氮代谢的关键酶，在铵盐同化方面发挥着重要作用。本研究发现，氮高效品种的谷氨酰胺合成酶活性在高氮和低氮处理下均大于氮低效品种，且氮高效品种的谷氨酰胺合成酶活性在齐穗期、开花期和花后15 d三个生育时期均显著高于氮低效品种，表明氮高效品种具有更强的铵同化能力。

氮素积累量反映作物的吸收能力。本研究发现，氮高效品种在高氮和低氮处理下拔节期、开花期和成熟期的氮素积累量均高于氮低效品种，另外，氮高效品种在低氮处理下，其氮素积累量较高氮环境的降低幅度显著小于氮低效品种，这与本研究发现的低氮处理下氮高效品种在根系形态和活力、硝酸盐转运蛋白基因表达模式以及氮代谢关键酶的自我调节适应性的变化是一致的。这也表明，改良小麦品种的氮效率特性，可从根系形态特性、根系活力、硝态氮转运蛋白相关基因以及氮代谢关键酶等因素来考虑，实现这几个因素的有机结合。在今后小麦氮高效遗传育种中，可着重考虑这几个影响氮效率的关键因素，通过传统育种、分子辅助选择技术、转基因以及基因编辑技术等多途径实现多种相关氮效率因素的有机结合，选育出更高效、更绿色的新品种。

4 结 论

氮高效品种和氮低效品种在低氮处理下其根系相关性状(根长、根表面积、根直径、根体积、根尖数和根系活力)以及硝酸盐转运蛋白相关基因(TaNRT2.1、TaNRT2.2、TaNRT2.3、TaNAR2.1、TaNAR2.2和TaNAR2.3)的表达水平均高于高氮处理，但氮高效品种的增幅大于氮低效品种；氮高效品种氮代谢关键酶(硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶)的活性高于氮低效品种，低氮处理下均有所降低，但氮高效品种的降幅小于氮低效品种。这些结果在一定程度上解释了氮高效品种在各个生长时期的氮素积累量均比氮低效品种高的原因。根系形态、根系活力、硝酸转运蛋白相关基因和氮代谢关键酶活性的综合改良是选育氮高效品种的基础。