结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白免疫小鼠效果初步评价

栾秀丽，范雪亭，王瑞欢，李马超，于晋杰,2，钱程宇，3，曹 斌,2，赵秀芹，刘志广，刘海灿，李桂莲，万康林

结核病(tuberculosis，TB)是一种主要经呼吸道传播结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染导致的全身性慢性传染病，以肺结核为主，在世界范围内造成了沉重的疾病负担。疫苗接种可以降低人类结核病感染的发病率和严重程度，在全世界范围内获批使用的卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin vaccine,BCG)虽然具有部分保护作用，但未能充分保护青少年和成人免受结核分枝杆菌感染[1]。因此，迫切需要开发新的更有效的抗结核疫苗。

培养滤液蛋白-10(Culture filtrate protein-10, CFP-10)和早期分泌抗原靶6kDa蛋白(early secretary antigentic target 6kDa protein, ESAT-6)是结核分枝杆菌基因组RD1区基因编码的早期分泌的蛋白质，是与毒力相关的T细胞蛋白抗原，其T细胞表位覆盖率达100%。CFP10和ESAT6基因在MTB中同时转录[2]，CFP10位于ESAT6的上游，两个基因同属于一个操纵子，由同一个启动子调节转录。当MTB被巨噬细胞吞噬时，CFP10和ESAT6形成异质二聚体(EsxAB)共同分泌[3], 该复合物可通过CFP10的c端形成的长柔性臂与巨噬细胞和单核细胞表面特异性结合[4]，并且CE复合物可以抑制吞噬溶酶体融合[5]，利于其在宿主细胞内生存，增强致病性分枝杆菌的毒力。因为CFP10与ESAT6具有相同的免疫学特性，并且在体内能按1∶1紧密连接形成杂二聚体[6]，体外模仿这种结构构建的CE融合蛋白比单个蛋白在疫苗和诊断方面更具研究和应用价值[7-9]。

以往对于CE融合蛋白的研究多集中于蛋白的抗原性与免疫机制方面的研究，CE融合蛋白可以通过皮试诊断结核感染[10]或者鉴别致敏机体的不同分枝杆菌[11]，以及通过ELISA实验对结核病进行血清学辅助诊断[12-14]，并且有研究发现CE融合蛋白能够活化巨噬细胞[15]，在感染早期可能具有重要的抗结核保护作用[16]，上述研究证明了CE融合蛋白具有特异的免疫原性，为CE融合蛋白作为免疫优势抗原在结核病诊断与参与疫苗研制方面提供了一定参考。与CE抗原基因排列顺序相反的EC融合蛋白，同样在血清学诊断与皮肤试验中具有良好的表现[17-18]，除此之外还有研究对EC融合蛋白诱导小鼠的免疫应答及其保护力进行了评价，通过检测EC融合蛋白诱导产生的IFN-γ与IL-2以及攻击感染H37Rv后的脾脏菌落计数认为EC可以诱导机体产生特异性细胞免疫应答[19]，并且融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌能诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,并对感染小鼠有一定保护力[20]。

佐剂与人体产生的免疫反应程度相关，对亚单位疫苗的质量也有着重要影响。研究发现铝佐剂以促进抗体介导的保护性免疫应答为主[21-22]，但其本身不具备免疫原性，而是作为吸附剂起作用。铝佐剂在疫苗溶液中能强烈吸附抗原形成沉淀[23]，接种此类疫苗后可在机体内形成抗原贮存库，缓释抗原以延长疫苗发挥作用的时间，并促进注射部位的巨噬细胞反应以及促炎NLRP3通路的激活。铝佐剂安全性高[24]，目前已广泛应用于人类疫苗中。本研究拟采用铝佐剂作为给药系统，探讨CE融合蛋白免疫小鼠引起的免疫应答特性。

本研究使用CE融合蛋白混合铝佐剂免疫小鼠，以BCG免疫组为阳性对照、PBS免疫组作为空白对照、单纯铝佐剂免疫组为阴性对照，结合体外MGIA及小鼠特异性抗体和9种细胞因子变化，初步评价CE免疫效果。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和载体 H37Rv (ATCC 27294)、BCG-China (D2PB302)、含MTB融合蛋白CE对应基因的重组pET32a(+)质粒与含重组质粒的E.coliBL21(DE3)大肠杆菌均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传代、培养和保存。

1.1.2 主要试剂 氢氧化铝佐剂(简称铝佐剂)购自美国赛默飞世尔科技公司，小鼠IFN-γ与IL-4检测ELISpot预包被板购自北京达科为生物技术有限公司，Luminex多细胞因子检测试剂盒购自美国RD-Biotechne公司，小鼠淋巴细胞分离液购自北京达科为生物技术有限公司，辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)标记的羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a抗体购自苏州博奥龙科技有限公司。

1.1.3 BABL/c小鼠 6～8周龄、雌性、SPF级, 购自维通利华公司，饲养于中国疾病预防控制中心动物中心。

1.2 方 法

1.2.1 CE抗原的诱导与表达纯化 实验室前期已将CFP10与ESAT6编码基因串联，并经EcoR I与Hind III酶切位点连接在pET32a(+)质粒上，构成重组质粒，转化至E.coliBL21(DE3)大肠杆菌。本实验挑取LB固体平板生长的新鲜重组菌落加入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min摇床扩菌培养至OD600值达到0.6～0.8，向菌液中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-d-galactoside，IPTG，终浓度为1 mmol/L)，继续振摇培养诱导4 h。提取重组菌中蛋白并用SDS-PAGE确认目的蛋白表达后，用Ni-NTA层析进行纯化，使用ToxinEraser内毒素清除试剂盒去除重组蛋白中的内毒素，然后使用BCA蛋白定量试剂盒测定浓度后用0.22 μm滤器过滤除菌，用PBS将蛋白稀释定量至333 μg/mL。

1.2.2 BCG的菌落计数与全菌蛋白提取

1.2.2.1 BCG-China菌悬液 刮取生长于罗氏培养基的新鲜BCG-China菌落置于PBS中，用超声分散仪分散菌体：1)调整其浓度至OD600值为1后，进行10倍梯度稀释，将不同稀释度的菌液涂布7H10平板，两周后获得各稀释浓度的细菌计数(CFU)，计算出OD600=1的菌液对应的菌落个数，用于推算实验中使用的菌落数；2)反复离心洗涤后用PBS调整菌液浓度为5×106/mL，用于免疫小鼠。

1.2.2.2 BCG-China全菌蛋白提取 从罗氏培养基上刮取适量新鲜菌体，PBS反复清洗后，80 ℃水浴灭活，冰上超声，随后离心收集上清液，测定上清液中的全菌蛋白浓度后用0.22 μm滤器将蛋白过滤除菌。

1.2.3 小鼠免疫 将BALB/c小鼠随机分为4组，每组6只。CE组，每只每次免疫采用含25%(体积百分浓度，V/V)铝佐剂的333 μg/mL CE蛋白/铝佐剂混合物200 μL；阴性对照组即佐剂组，每只每次免疫采用含25%(V/V)铝佐剂的0.01 mol/L pH7.2 PBS 200 μL；空白对照组，每只每次免疫采用0.01 mol/L pH7.2 PBS 200 μL；阳性对照即BCG组，免疫采用BCG菌液200 μL (5×106个菌/mL)[19]。 一免前采集小鼠本底血，BCG组小鼠于背部皮下多点注射免疫1次。其余各组小鼠于第1、11和21 d分3次背部皮下多点注射免疫。末次免疫结束后7 d统一处死所有BALB/c小鼠，采集血液和脾脏标本，进行免疫学检测。

1.2.4 体液免疫水平检测 采用ELISA法测定小鼠血清中特异性总IgG以及IgGl和IgG2a的抗体滴度。用2 μg/mL的CE融合蛋白或BCG全菌蛋白作为抗原，每孔100 μL包被96孔ELISA板，一抗为PBS倍比稀释的免疫试验小鼠血清，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG和IgG1、IgG2a抗体。OD600值大于佐剂组或PBS组血清的2.1倍时，即是(蛋白免疫组OD600值-同体本底OD600值)/(佐剂组OD600值-同体本底OD600值)>2.1，结果判定为阳性，该样品的稀释倍数为对应的抗体滴度。每次试验设置复孔，并检测3个生物学重复。

1.2.5 ELISpot法检测IFN-γ与IL-4的分泌情况 小鼠处死后，用淋巴细胞分离液提取脾脏淋巴细胞，调整淋巴细胞至终浓度为1×106个细胞/mL。按照ELISpot预包被板的说明书操作，活化板子后每孔加入100 μL细胞。CE和佐剂组细胞均用2 μg CE融合蛋白抗原刺激，BCG组细胞用2 μg BCG全菌蛋白抗原刺激，PBS组用2 μg CE融合蛋白抗原刺激。每组均设阳性对照孔和空白对照孔，分别加入500 ng ConA和100 μL培养基。将上述处理后的细胞置37 ℃、5% CO2静置培养20 h后，加入生物素标记的IFN-γ与IL-4抗体以及酶联亲和素，进而检测分泌特异性IFN-γ与IL-4的细胞数。每次试验设置复孔，并检测3个生物学重复。

1.2.6 Luminex细胞因子检测 准备96孔细胞培养板，每孔加入100 μL浓度为1×106个细胞/mL的小鼠脾淋巴细胞。CE和佐剂组细胞均用10 μg CE融合蛋白抗原刺激，BCG组用10 μg BCG全菌蛋白抗原刺激，PBS组用10 μg CE融合蛋白抗原刺激。将以上细胞置37 ℃、5% CO2静置培养20 h后，收集孔内液体与细胞。按照小鼠多重细胞因子分析试剂盒的说明书操作，同时检测IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-2、IL-12p70、IL-6、IL-10、IL-4和IL-17/IL-17A共9种细胞因子的表达水平。简言之，向96孔检测板每孔加入50 μL样品或标准品后，各加入50 μL微球混合物，室温震荡培养2 h后，分别孵育生物素抗体以及PE标记链霉亲和素，进而检测各孔的细胞因子浓度。每次试验设置复孔，并检测3个生物学重复。

1.2.7 结核分枝杆菌体外生长抑制试验 收集小鼠脾淋巴细胞，用含1×非必需氨基酸、10 mmol/L Hepes、1 mmol/L丙酮酸钠和5×10-5M 2-巯基乙醇的完全1640细胞培养基调整细胞浓度至2×106个细胞/mL。从罗氏培养基刮下新鲜的H37Rv，用重悬细胞的完全1640细胞培养基梯度稀释H37Rv，并于1 h内将500 μL 100 CFU/mL 的H37Rv添加到含500 μL 2×106个脾细胞/mL的24孔板中，置37 ℃、5% CO2共培养4 d。培养第4 d时取出24孔板，收集每孔的培养物离心弃上清。同时向24孔板每孔加入500 μL无菌组织培养级水，室温孵育至少5 min，然后将水完全移出，加到上述沉淀中，进行10倍和100倍稀释，然后将原液与稀释后的样品涂布7H10平板，每组脾细胞检测均设置复孔，并检测4个生物学重复。约14 d后计算每板CFU (colony-forming unit)数，最终实验数据以每孔样品的log10CFU表示并进行组间比较。

2 结 果

2.1 蛋白的纯化结果 SDS-PAGE结果显示，CE融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达(图1)。重组蛋白分子中含有的质粒pET-32a上携带的融合表达的His标签、S标签和Trx标签(分子量共约为19 kDa)。包含标签的重组蛋白CE，总分子量约为40 kDa，电泳结果显示蛋白分子量与预期相符且纯度较高(图1)，可用于后续的免疫实验。

注：图中M为蛋白Marker；列1为未诱导的转化大肠杆菌的pET32a-CE；列2,3分别为诱导后的pET32a-CE经超声离心的包涵体沉淀和上清；列4为纯化后的重组蛋白CE。图1 SDS-PAGE分析重组蛋白CE的表达纯化结果Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purification and expression of recombinant protein CE

2.2 抗原的特异性体液免疫应答 由于佐剂免疫组与PBS组在ELISA检测中吸光度相近且较低，我们选择前者作为阴性对照组。CE组诱导的特异性IgG、IgG1和IgG2a滴度均高于阴性对照组；且前者的IgG1与IgG2a水平均高于BCG组(t值分别为19.1和8.7，P值均<0.000 1)，见图2A，但两组间IgG水平和IgG1/IgG2a值的差异无统计学意义(2.1vs.2.0，t=0.87，P>0.05)，见图2B。

注：(A) CE组和BCG组总IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度的比较结果；(B) CE组和BCG组抗体IgG1/IgG2a的比较结果。④P<0.000 1。图2 CE与BCG免疫BALB/c小鼠血清IgG、IgG1和IgG2a的比较Fig.2 Comparisons on the IgG, IgG1 and IgG2a isotypes in the sera between CE and BCG immunized BALB/c mice

2.3 不同免疫组分泌IFN-γ与IL-4的细胞数检测 CE组分泌IFN-γ与IL-4的斑点形成细胞(Spot Forming Cell，SFC)数均分别高于PBS组与佐剂组；CE组与BCG组相比，分泌IFN-γ的SFC数差异无统计学意义(t=0.4，P>0.05)，见图3A，但CE组分泌IL-4的SFC数高于BCG组(t=8.0,P<0.000 1)，见图3B。

注：A. 小鼠脾细胞经体外抗原刺激后产生的IFN-γ的SFC数；B. 产生的IL-4的SFC数。CE组和BCG组之间的统计学显著性差异用两组间线上的数字表示，CE组与PBS组和佐剂组之间的统计学差异用PBS组和佐剂组柱上的数字表示，①P<0.05, ④P<0.000 1。图3 不同免疫组的BALB/c小鼠分泌IFN-γ与IL-4的细胞数差异Fig.3 Difference of IFN-γ- and IL-4-secreting cells between BALB/c mice in different immune groups

2.4 不同免疫组细胞因子表达水平检测 用LUMINEX检测不同免疫组小鼠脾淋巴细胞经CE或BCG全菌蛋白刺激后9种细胞因子表达水平的组间差异。如图4所示， CE组刺激诱导产生的9种细胞因子均高于PBS和佐剂组。CE组刺激诱导产生的GM-CSF、IL-6、IL-10、IL-4高于BCG组(tGM-CSF=8.4，P<0.000 1；tIL-6=8.3，P<0.000 1；tIL-10=2.5，P<0.05；tIL-4=7.0，P<0.000 1)，而IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12 p70、IL-17/IL-17A等细胞因子未发现差异有统计学意义，然而，CE组的IFN-γ/IL-4值低于BCG组(2.3vs6.1,t=3.4,P<0.05)。

注：小鼠脾细胞经体外抗原刺激后产生的A. IFN-γ浓度；B. TNF-α浓度；C. GM-CSF浓度；D. IL-2浓度；E. IL-12 p70浓度；F. IL-6浓度；G. IL-10浓度；H. IL-4浓度；I. IL-17/IL-17A浓度。CE组与BCG组之间的统计学差异用两组间线上的数字表示，CE组与PBS组和佐剂组之间的差异用PBS组和佐剂组柱上方的数字表示，①P<0.05, ②P<0.01, ③P<0.001, ④P<0.000 1。图4 免疫小鼠脾细胞释放的抗原特异性细胞因子水平Fig.4 Antigen specific cytokine levels released from the splenocytes of the immunized mice

2.5 不同免疫组的分枝杆菌体外生长抑制试验结果 将不同免疫组的脾细胞与分枝杆菌共培养4 d后，用水裂解细胞释放胞内的分枝杆菌并涂板，计算结核分枝杆菌生长菌落数，并比较不同组间菌落数差异。结果发现，CE组CFU数均低于PBS与佐剂组(tPBS=8.2，t佐剂组=7.4，均P<0.000 1)，CE组与BCG组间的CFU数差异无统计学意义(t=0.8，P>0.05，图5)。

注：小鼠脾细胞体外与H37Rv共培养后，各免疫组的分支杆菌生长抑制情况，CE组与PBS组和佐剂组之间的差异用PBS组和佐剂组柱上方的数字表示，④P<0.000 1。图5 免疫小鼠体外抑制分枝杆菌生长的结果Fig.5 Results of in vitro inhibition of Mycobacterium tuberculosis growth in immunized mice

3 讨 论

亚单位疫苗的主要缺点之一是单一抗原导致的弱免疫原性，因而将强免疫原性的蛋白融合表达是提高蛋白疫苗免疫原性和保护效率的有效策略[24]。ESAT6具有潜在的溶细胞活性，曾有研究将ESAT6与Ag85B一同构建融合蛋白，此举虽然减弱了ESAT6的细胞溶解活性，提高了抗原的免疫原性，但是没有明显提高免疫保护作用[25]。CFP10和ESAT6两个基因位置毗邻，能够同时转录，协同表达，并在功能上也以复合物的形式发挥作用[4]。CFP10与ESAT6的单个蛋白分子量较小，但两者串联融合后分子量增大，稳定性较好，有利于提高蛋白的免疫原性。有研究将CFP10和ESAT6这两个强T细胞免疫优势抗原融合表达，形成保持在结核分枝杆菌中的天然位置顺序的CE融合蛋白，经实验发现具有良好的抗原性[26]，且被证明能够辅助诊断结核[14,27]。为系统评价2个蛋白融合后的免疫反应表现，本研究使用CE融合蛋白，并结合倾向诱导体液免疫反应的铝佐剂免疫小鼠，以初步探讨CE融合蛋白的免疫效果。

虽然人体对MTB的防御以细胞免疫为主，但近年来的研究发现体液免疫与细胞免疫相互协调，共同参与对MTB的免疫防御：与抗体结合的MTB复合物更容易被巨噬细胞通过结晶段受体(FcRs)和补体受体吞噬[28]；针对MTB的特异性抗体可促进吞噬溶酶体融合；MTB特异性抗体也可通过自然杀伤(NK)细胞介导的抗体依赖的细胞毒性刺激杀伤MTB感染的宿主细胞，此外，MTB特异性抗体可能具有直接杀灭菌体的能力或中和活性，这种特异性抗体已被证明能够促进巨噬细胞中的炎性小体激活。我们的研究结果表明，CE融合蛋白免疫小鼠后可诱导高水平的抗原特异性IgG、IgG1和IgG2a的分泌。IgG2a是CD4+Th1型抗体，而IgG1是CD4+Th2型抗体，当IgG1/IgG2a比值大于1时，免疫反应倾向于Th2型。本研究虽然CE融合蛋白诱导的IgG1与IgG2a水平均高于BCG组，但CE组与BCG组的IgG1/IgG2a比值均大于1，且差异无统计学意义, 表明CE诱导了类似BCG的偏向CD4+Th2型的细胞免疫反应，提示CE融合蛋白与铝佐剂混合具有较强诱导体液免疫应答的能力。

本研究利用ELISpot和ELISA技术检测了与机体免疫防御MTB有关的9种细胞因子，包括IFN-γ，TNF-α，GM-CSF，IL-2，IL-12p70，IL-6，IL-10，IL-4和IL-17/IL-17A。目前已知树突状细胞、巨噬细胞、B细胞等抗原提呈细胞在机体先天免疫和适应性免疫之间中具有重要的作用。粒细胞-巨噬T细胞分泌的细胞集落刺激因子(GM-CSF)可以促进树突状细胞的增殖和成熟[29]，成熟的树突状细胞可分泌多种已被证实具有保护作用的细胞因子如IL-12、TNF-α和IFN-γ，这些细胞因子作用于天然CD4+T细胞(Th0细胞)使其分化为Th1细胞。Th1细胞产生的IFN-γ、IL-2和TNF-α能有效激活CD8+T细胞和巨噬细胞，CD8+T细胞通过产生穿孔素、颗粒酶、活性氧和活性氮等清除细胞内MTB。成熟的树突状细胞还可以产生IL-4，使Th0细胞分化为Th2细胞，Th2细胞通过分泌IL-4、IL-5和IL-10等介导体液免疫反应，从而影响B淋巴细胞的功能[30]。此外，促炎细胞因子IL-17的产生以及Th17的反应性对于控制小鼠MTB感染很重要，IL-17可诱导多种分子的产生[31]，包括与粒细胞生成、中性粒细胞或淋巴细胞募集和先天免疫反应相关的促炎细胞因子(如IL-6、TNF-α和IL-1β，这些参与巨噬细胞向促炎性杀菌Ⅰ型极化的细胞因子，可将单核细胞招募到感染损伤部位并激活单核细胞参与杀死病原体，从而启动抑制分枝杆菌生长的一系列事件)和一些趋化因子及抗菌分子。

本研究结果发现，CE组诱导产生的IFN-γ无论是检测SFC数量还是细胞因子浓度，与BCG组比较，均未发现差异有统计学意义，但是CE组IL-4的SFC数量以及细胞因子浓度均高于BCG组，且CE组的IFN-γ/IL-4 比值显著低于BCG组，表明虽然实验使用了诱导偏向CD4+Th2型细胞免疫的铝佐剂，CE抗原经细胞因子检测仍旧体现出类似BCG免疫的偏向CD4+Th1型的细胞免疫反应，只是程度稍弱，因此CE抗原与铝佐剂混合免疫引起了Th1与Th2混合型免疫反应。此外，CE组诱导产生了与BCG组相同水平的保护性细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12、IL-17，而且CE组诱导产生的GM-CSF、IL-6、IL-10、IL-4高于BCG组，表明了CE融合蛋白与铝佐剂混合免疫，具有诱导小鼠产生高水平细胞免疫应答的能力。

目前尚无明确的可评价肺结核保护性免疫的相关检测指标，因此常采用观察接种疫苗动物经攻毒实验后，抑制分枝杆菌复制能力的方法来评价疫苗保护效果。而且由于MTB的胞内生存方式，能够抑制体内分枝杆菌复制的免疫反应从逻辑上可定义为保护性反应，研究发现体外分枝杆菌生长抑制试验(Mycobacterial growth inhibion assay，MGIA)可将多种体外功能试验与保护效果相联系，如从BCG免疫小鼠的脾细胞可观察到重复的分枝杆菌生长抑制现象，并且抑制效果与免疫后攻毒实验的体内抑菌效果一致[32]。因此，借助MGIA评价疫苗效果被认为是选择候选疫苗或快速进入昂贵的疫苗临床开发阶段的筛选策略[33]。需要注意的是，尽管MGIA实验有一定的评价效果，但其还不能取代体内攻毒实验。

采用MGIA观察疫苗抑制MTB增殖的效果，虽然与免疫-动物攻毒-细菌载量评价具有一定的差距，但也为抗原的免疫保护性能预测提供了一定的依据。本研究的MGIA结果显示，CE组小鼠脾淋巴细胞与H37Rv共培养后的CFU均显著低于PBS与佐剂组，表明CE组可以在体外抑制H37Rv的生长，并且CE组的CFU与BCG组未发现差异有统计学意义，表明这种体外抑制程度与BCG组相当，提示CE融合蛋白与铝佐剂混合免疫具有诱导小鼠产生抗MTB感染免疫保护性的能力。

综上所述，在对CFP10和ESAT6串联融合表达的CE融合抗原免疫小鼠效果的初步探索中，我们发现CE融合抗原具有良好的免疫原性，与铝佐剂混合使用可以诱导小鼠产生类似BCG的Th1与Th2混合型免疫反应，并且具有与BCG免疫相当的体外抑制MTB生长的能力，表明CE具有良好的结核疫苗研制应用价值，可作为研制结核病新疫苗的候选成分之一，为进一步研究结核病新疫苗提供了科学基础。本研究检测了与机体免疫防御MTB有关的9种细胞因子，并使用了铝佐剂增强免疫效果，但是本研究仅对于各项检测指标在免疫后29 d进行了检测，而且本次研究使用了同一批次的小鼠并在评估CE抑制MTB生长的能力的时候使用了MGIA这一体外实验，因此在后续的研究中我们将进行不同批次小鼠的免疫，检测多个时间点，并进一步采用体内攻毒实验观察CE联合其他免疫优势抗原接种动物模型后是否使其拥有抑制MTB在体内生长的能力，并进行免疫效果的评价。

利益冲突：无

引用本文格式：栾秀丽，范雪亭，王瑞欢，等. 结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白免疫小鼠效果初步评价[J]. 中国人兽共患病学报，2022，38(7)：589-596. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.093