江西地区啮齿动物中温州病毒的检测及病毒基因特征分析

刘师文，李健雄，施 勇，熊 英，吴杨博文，龚 甜

温州病毒(Wenzhou mammarenavirus，WENV)是2015年首次报道的沙粒病毒新种[1]。沙粒病毒属沙粒病毒科，是有包膜的负链RNA病毒，基因组分大(L)、小(S)2个节段，大小分别约7.2 kb、3.5 kb。L 段编码病毒 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 (RdRp) 和作为基质蛋白的锌结合蛋白(Z)， S 区段编码病毒糖蛋白前体 (GPC) 和核蛋白 (NP)[2]。沙粒病毒科成员分为4个属，与人类关系最密切的为哺乳动物沙粒病毒属(mammarenavirus，MARV)，啮齿动物是该属病毒最主要的宿主，啮齿动物感染 MARV 一般不表现任何临床症状，人直接或间接接触鼠类( 包括排泄物) 感染病毒而发病。人类阿根廷出血热、拉萨热、玻利维亚出血热等严重的发热出血相关疾病都由该属病毒引起[3]。MARV属中发现的新病毒可能具有严重的致病性和致死性，因此，需要探究其生物学特征、地理分布情况和感染人的证据，提高对它们的监测和诊断能力，以降低潜在的人兽共患病风险。

WENV作为MARV属新种于2015年首次被报道，随后中国云南、海南、山东、广东、新疆、湖南以及东南亚等地区有发现[4-10]，其他地方暂未见有关报道。江西地区啮齿动物物种丰富，是人兽共患病的热点地区，由啮齿动物引起的肾综合征出热发病率最高达21.69/10万。因此，了解新发病毒在江西啮齿动物中的流行对于准确预测本地潜在人兽共患病的风险至关重要。高安市、安义县是江西省肾综合征出血热宿主动物监测点，为了解该新病毒是否在江西地区有流行，本研究对江西省高安市、安义县采集的啮齿动物肺标本进行WENV检测及病毒基因组测序分析，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 组织破碎仪(Next Advance)、96道核酸提取仪(QIAGEN)、PCR仪(eppendorf)、凝胶成像仪(BIO-RAD)、基因测序仪Ion Gene Studio S5(Thermo Fisher)，PrimScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 (TAKARA)、GoTaq○RGreen Master Mix(Promega)、NuGEN Ovation○RRNA-Seq System V2(NuGEN)、文库制备及测序上机试剂(Thermo Fisher)

1.2 样本处理 收集2021年江西高安市、安义县两地室内和室外采集的鼠肺样本。取适量鼠肺至1.5 mL离心管中，加入无菌1×PBS溶液，盖好离心管盖放至组织破碎仪粉碎2 min，制成10%鼠肺样本悬液，悬液经6 000 g，4 ℃离心10 min后取上清液提取核酸。核酸提取按照QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒说明进行。

1.3 巢式PCR检测WENV核酸 参照文献[1]，合成两对扩增WENV部分L基因引物，第1次RT-PCR扩增采用第1对引物和PrimScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2试剂。第2次PCR以第1次扩增产物为模板，采用第2对引物和GoTaq○RGreen Master Mix试剂扩增，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行验证，目的产物大小610 bp。阳性PCR产物送上海生物工程有限公司进行测序。

1.4 病毒全基因组测序 选取一个WENV阳性样本核酸，采用NuGEN Ovation○RRNA-Seq System V2试剂进行逆转录、cDNA链合成、cDNA扩增回收；采用Ion XpressTMPlus Reagents Kit、Ion XpressTMPlus Fragment Library Kit、Ion 520TM&Ion 530TMOT2 Reagents等试剂进行文库构建和测序微球(Ion SphereTMParticles)模板的制备，文库读长约200 bp。将测序微球加入到Ion 530TM芯片，在Ion Gene Studio S5 平台进行测序。

1.5 基因序列分析 选择WENV Rn366株作为参考序列，采用CLC软件(CLC Genomics Workbench 21)对测序仪原始数据进行比对、拼接获得待测毒株的基因组序列。下载GenBank WENV参考序列(表1)，用MEGA X软件对基因序列进行比对分析，以最大似然法进行分析构建系统进化树(bootstrap值：1 000)。

表1 WENV参考株序列信息Tab.1 Sequence information of reference strains

2 结 果

2.1 WENV核酸检测 共收集7种啮齿动物肺组织样本164份，其中黑线姬鼠66份、黄毛鼠39份、小家鼠21份、黄胸鼠15份、褐家鼠9份、社鼠7份、鼩鼱7份。按地区安义县102份、高安市62份。共检出WENV核酸阳性3份(1.83%，3/164)，巢式PCR电泳图见图1，阳性样本均来自高安地区黄毛鼠(7.69%，3/39)。

注：泳道1-5分别为：Marker、JXGAW45/2021、JXGAW46/2021、JXGAW56/2021、阴性对照。图1 巢式PCR产物凝胶电泳图Fig.1 Gel electrophoresis of nested PCR products

2.2 3株WENV部分L基因测序 对JXGAW45/2021、JXGAW46/2021、JXGAW56/2021这3个阳性样本进行了部分L基因测序，3株病毒之间核苷酸序列(长度566 bp)同源性93.66%～98.50%，氨基酸序列同源性95.21%～100%。与GenBank中其他14株WENV部分L基因核苷酸同源性为81.60%～88.98%，均与9-24株同源性最高，分别为88.98%、88.15%、88.98%。系统进化分析见图2，江西WENV在部分L基因系统进化树中独立分支。

WENV全S、L基因系统进化分析见图2、3，本研究获得的序列用黑三角形图标。

图2 L片段部分基因系统进化分析(566 bp)Fig.2 Phylogenetic analysis of WENV based on partial L segment

2.3 JXGAW45/2021株全基因组序列分析 选取JXGAW45/2021进行NGS测序，获得2.0G的测序数据，经比对、拼接获得基因全序，其中S、L分别含3 429、7 145个核苷酸，序列已上传GenBank，登录号分别为：OL738673、OL738674。

S基因存在两个相对的开放阅读编码区，分别编码：GP(ORF：132～1 610)共492个氨基酸，NP(ORF：1 673～3 376)共567个氨基酸，2个开放阅读框中间存在63个核苷酸间隔序列。L基因存在两个相对的开放阅读编码区，分别编码：Z(ORF：53-328)共91个氨基酸，RdRp共2 228个氨基酸(ORF：443-7129)，2个开放阅读框中间存在115个核苷酸间隔序列。

核苷酸全序列同源性比较结果见表2，JXGAW45/2021与其他WENV核苷酸全序列同源性为82.58%～85.75%，氨基酸同源性为88.76%～96.83%。S、L全序核苷酸与浙江分离株Rn-242株同源性最高，分别为85.75%、84.95%。和其他种沙粒病毒相比，与LORV核苷酸同源性最高分别为68.72%、62.80%。与LASV的糖蛋白氨基酸同源性达72.06%。WENV全S、L基因系统进化分析见图3和图4。

表2 JXGAW45/2021与其他病毒同源性比较Tab.2 Genome or ORF comparisons between JXGAW45/2021and other mammarenacirues

图3 WENV全S基因系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of WENV based on complete S segment

图4 WENV全L基因系统进化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of WENV based on complete L segment

3 讨 论

2015年在浙江省首次发现WENV以后，至今在中国6个省份以及东南亚3个国家相继被发现，提示该病毒地理分布广泛。多数沙粒病毒的宿主动物仅一种，而WENV宿主广泛，如褐家鼠、小家属、黄胸鼠、黄毛鼠、社鼠等[4-11]。WENV与广泛分布的不同物种的啮齿动物(通常在人类居住地和近郊栖息地中发现)的关联说明了广泛的人兽共患病传播的可能性。江西地区尚无WENV相关病毒的报道。本研究调查了江西省高安市和安义县两地野生啮齿动物的WENV感染情况，结果表明，7种啮齿动物中仅黄毛鼠存在WENV的核酸，总检出率1.83%，黄毛鼠检出率7.69%。所有WENV阳性样本均来自从高安地区。广州和云南的啮齿动物调查研究结果表明WENV的分布可能仅限于当地小面积范围[11,4]。江西地区是否仅高安地区存在WENV，后期还需要进行更大范围的调查。在江西，黄毛鼠是优势物种之一，与人类共生，这表明WENV溢出的风险很高。建立特异性强的WENV血清学试验对比流行地区和非流行地区人群抗体水平，对于判断WENV是否作为人类病原体非常必要。

病毒分类委员会规定同种沙粒病毒的S、L基因核苷酸同源性需分别大于80%、76%。本研究通过高通量测序获得GAW45/2021的全基因组序列，S、L片段核苷酸序列与WENV参考株核苷酸同源性均大于80%，与其他种沙粒病毒核苷酸同源性小于70%，属WENV种。与WENV参考株相比，GAW45/2021 S基因变异在14%以上、L基因变异在15%以上；部分L基因及S、L全基因系统进化分析均显示GAW45/2021 在WENV进化树中程独立分支，为WENV新的变异株。部分L基因系统进化树分支结构与L全基因系统进化树分支结构不同，显示了WENV系统进化的复杂性，提示WENV系统进化时分析应尽可能采用全基因序列。

一项WENV感染对鼠啮齿动物发育的潜在致畸作用研究表明，WENV感染可影响自然宿主生理和影响发育过程[12]。北京和山东地区的健康人群血清学调查发现，全人群WENV抗体阳性率为1.5%～4.6%，表明WENV在人群中可能存在散发感染[13]。WENV缅甸变异株核酸在呼吸道感染病例中被检出，因病例数量有限或混合感染，WENV与疾病的因果关系还需进一步确定[10]。WENV对动物和人疾病关联的报道都显示了其可能的潜在致病性。

江西地区WENV的发现丰富了WENV的地理分布，证实了江西人群存在潜在的WENV感染风险；病毒全基因组序列信息的获得，有助于更好地了解WENV的起源和进化模式，也为建立该病毒实验室监测技术奠定了基础。

利益冲突：无

引用本文格式：刘师文，李健雄，施勇，等. 江西地区啮齿动物中温州病毒的检测及病毒基因特征分析[J].中国人兽共患病学报，2022，38(7)：597-601. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.078