24株停乳链球菌似马亚种的分子鉴定和基因分型

何放晴，李曲文,2，张志珊，邓艳琴,2

停乳链球菌似马亚种(Streptococcusdysgalactiaesubspeciesequisimilis，SDSE)长期以来一直被认为是人类呼吸道和皮肤的正常菌群之一，但近年来在世界范围内关于该菌引起感染的报道越来越多，已被视为重要的致病菌[1-2]。与化脓性链球菌的临床症状十分相似，SDSE可引起人类侵袭性和非侵袭性疾病，如链球菌中毒性休克综合征(STSS)、败血症、皮肤和软组织感染、肺炎和咽炎等[3-4]。SDSE在感染C群链球菌(GCS)和G群链球菌(GGS)的患者中分离率最高，例如，2006-2007年在印度地区临床标本中分离的313株GCS和GGS中，约81%的菌株为SDSE[5]。据报道，SDSE引起的感染占人类链球菌疾病的5.8%，通常发生在老年患者或有基础疾病的患者中[6]。停乳链球菌在女性生殖道中也十分常见[7]，新生儿感染SDSE时有发生，余丽阳等[8]的研究发现，1 岁以内的婴幼儿可通过母婴产道或哺乳等垂直传播方式感染SDSE致病。此外，停乳链球菌在畜牧业的报道并不罕见，主要多见于牛、羊等哺乳动物乳腺炎[9-10]，且国内因酸奶等乳制品导致的群体感染事件时有发生[11-13]。然而目前国内对该菌的相关性研究还较少，本研究通过对24株停乳链球菌似马亚种菌株的临床分布、鉴定及分子特征分析，旨在提升卫生工作者对SDSE感染性疾病的认识和预防控制能力。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 24株SDSE分离自2020-2021年福建省各类感染病例送检标本。其中，男性13例，女性11例，年龄分布在5～85岁，中位数为19岁。感染者在入院采集标本前均未使用抗菌药物，剔除同一患者相同部位同一菌株。

1.2 实验仪器与试剂 VITEK 2 Compact 全自动微生物分析系统及配套的革兰阳性菌鉴定卡(生物梅里埃公司，法国)，CO2恒温培养箱(太仓艺思高科技有限公司，中国)，生物安全柜(东联哈尔仪器制造有限公司，中国)，Gel Doc XR+凝胶成像系统和电泳仪(伯乐公司，美国)，PCR扩增仪(赛默飞世尔科技公司，新加坡)，血平板(广东环凯生物科技有限公司，中国)，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪及MSP 96 孔靶板、 α-氰基-4-羟基肉桂酸基质(HCCA)(Bruker公司，德国)，DL2000 DNA Marker和Premix Taq(宝生物工程有限公司，中国)，所有引物均由福州铂尚有限公司合成。

1.3 方 法

1.3.1 菌株培养和DNA提取 将采集的各类标本接种至血平板上，37 ℃、5% CO2培养24 h后观察，挑取有β溶血环的菌落进行分离纯化。

刮取1接种环纯菌苔研磨于300 μL灭菌水中,混匀，100 ℃水浴 10 min。13 500×g离心 5 min，取上清液即为样品DNA。

1.3.2 菌种鉴定及亚种分型 挑取表面光滑、中等大小的有β溶血环的菌落，采用VITEK 2 Compact 全自动微生物分析系统的革兰阳性菌鉴定卡及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)，进行细菌鉴定； 采用多重PCR[14]进行停乳链球菌16S rRNA、SDSE亚种特异性链激酶前体基因(streptokinase precursor gene)的检测，并测序上传NCBI进行比对来最终确定菌种及亚种分型，所用引物序列和扩增长度见表1。3种鉴定方法均指示为停乳链球菌似马亚种时即纳入待分析菌株。

表1 16S rRNA和链激酶前体基因PCR扩增引物序列和产物大小Tab.1 Primer sequences and product size of 16S rRNA and streptokinase precursor gene

1.3.3 分子分型

1.3.3.1emm分型emm分型扩增引物(emm-F和emm-R)与emm分型测序引物(emm-seq)的合成(表2)及PCR反应条件参照美国疾病预防和控制中心(CDC)网站推荐(https://www.cdc.gov/streplab/protocol-emm-type.html)。扩增后的产物进行双向测序，将获得的序列提交到美国CDC链球菌实验室网络数据库进行同源性比对(https://www2.cdc.gov/vaccines/biotech/strepblast.asp)。

1.3.3.2 多位点序列分型 参考文献[15]，选取7个管家基因，即葡萄糖激酶(Glucose kinase，gki)、谷氨酰胺转运蛋白(Glutamine transport protein，gtr)、谷氨酸消旋酶(Glutamate racemase，murI)、DNA错配修复蛋白(DNA mismatch repair protein，mutS)、酮糖移转酶(Transketolase，recP)、黄嘌呤磷酸核糖转移酶(Xanthine phosphoribosyl transferase，xpt)、乙酰乙酰辅酶A硫解酶(Acetoacetyl-coathioloase，atoB)，进行扩增，所用的引物序列和扩增长度如表2所示。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，34个循环；72 ℃延伸10 min。扩增后的PCR产物送至福州铂尚公司进行测序，得到的样本序列上传至MLST网站(https://pubmlst.org/organisms/streptococcus-dysgalactiae)数据库进行比对后，MLST网站对每个管家基因的等位基因进行赋值，根据每个菌株的等位基因谱得到其对应序列分型(Sequence Types，STs)。进行BURST分析区分克隆群(Clonal complexes，CCs)，如果SDSE分离株与优势ST型共享5个或更多等位基因，则被分配为同一克隆群。采用BioNumerics 6.6软件对24株SDSE分离菌的MLST等位基因谱进行聚类分析。

表2 emm分型及MLST所用引物序列Tab.2 Primer sequences for emm typing and MLST

2 结 果

2.1 菌株鉴定情况 VITEK 2 Compact 细菌鉴定仪显示，24株菌的主要生化特性表现为蔗糖、D-核糖、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-甘露糖、D-半乳糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、α-葡糖苷酶、精氨酸双水解酶、丙氨酸芳胺酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、亮氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶阳性，D-甘露醇、D-山梨醇、D-棉子糖、尿素酶、L-吡咯烷酮芳胺酶阴性，奥普托欣、新生霉素耐药等，均符合停乳链球菌似马亚种；且经MALDI-TOF-MS的Bruker Biotyper 2.0数据库鉴定，24株菌均被鉴定为停乳链球菌，鉴定分值为2.24±0.07；后续在停乳链球菌16S rRNA及SDSE亚种特异性链激酶前体基因的PCR扩增中，分别扩增出大小约为401 bp及601 bp的目的片段，与预期扩增片段相符，且测序上传NCBI数据库进行BLAST分析比对，24株菌的16S rRNA基因的序列与数据库中的停乳链球菌比对相似度最高，为97.98%～100.00%；24株菌的链激酶前体基因的序列与数据库中的停乳链球菌似马亚种比对相似度最高，为98.19%～100.00%。综上，本研究中24株菌株均鉴定为停乳链球菌似马亚种。

2.2 标本临床分布情况 24株SDSE主要分离自咽拭子(14株)，占58.33%；其次为皮肤分泌物(5株)、血液(2株)、腹水(1株)、尿液(1株)、阴道分泌物(1株)。根据美国严重链球菌感染工作组的定义可将SDSE感染分为侵袭性和非侵袭性感染[16]，其中侵袭性感染4例，非侵袭性感染20例。

2.3emm分型 24株SDSE菌株被分成5种emm类型(表3)，分别为stCNSRT2.0、stG840.0、stG485.0、stG643.0、stG245.0，其中以stCNSRT2.0(n=16，66.7%)占优势，其次是stG840.0(n=3，12.5%)。在侵袭性感染中以stG840.0(n=2，50.0%)为主，在非侵袭性感染中以stCNSRT2.0(n=16，80.0%)为主。

表3 SDSE分离株的分子特征Tab.3 Molecular characteristics of SDSE isolates

2.4 MLST分型 对7个管家基因的扩增和测序比对显示，24株SDSE被分成6种序列型(表3)，分别为ST44、ST128、ST269、ST127、ST323、ST605，流行株以ST44(n=17，70.8%)为主，其次为ST128、ST269各2株。其中ST605为本研究中首次报告的新的ST型，ST605型的xpt基因与目前数据库中的等位基因型均不同，上传数据库后被定义为一个新的等位基因型xpt(113)。序列比对结果表明新定义的xpt(113)与xpt(85)之间仅存在一个碱基的差异(图1)。在侵袭性感染中无优势ST型，ST127、ST128、ST323、ST269各1株；在非侵袭性感染中以ST44(n=17，85.0%)为主。在单位点变异(Single Locus Variants，SLV)水平上，这些ST型被分为2个克隆群(CC)和2个独特型(Singleton)，其中克隆群以CC44/323(n=18，75.0%)占优势，其次是CC269/605(n=3，12.5%)；独特型分别是ST128(n=2，8.3%)和ST127(n=1，4.2%)。在侵袭性感染中，无优势克隆群，CC44/323和CC269/605各1株；而在非侵袭性感染中，CC44/323(n=17，85.0%)为优势克隆群。

图1 xpt(85)与xpt(113)等位基因的序列比对Fig.1 Sequence alignment of alleles between xpt(85) and xpt(113)

2.5emm分型与ST型的比较分析 stG485.0与ST128、stG643.0与ST269均具有良好的一致性。在emm分型stCNSRT2.0与ST44之间也观察到较高的相关性，在17株ST型为ST44的菌株中有16株emm分型均为stCNSRT2.0，仅1株emm分型为stG245.0。同时，我们的实验也观察到一种emm分型(stG840.0)与一种以上的ST型(ST127、ST323、ST605)相关联。在非侵袭性感染中，stCNSRT2.0与CC44/323具有较好的一致性；在侵袭性感染中，emm分型与克隆群之间未观察到明显的相关性。

2.6 菌株聚类分析 通过Bionumeric 6.6软件，对本研究中24株停乳链球菌似马亚种分离株MLST分型的7个位点、相应的ST型、克隆群以及菌株相关临床信息进行树状图聚类分析(图2)，菌株间相似度为13.9%～100%。其中ST44和ST323、ST269和ST605亲缘关系较近，在85%相似度水平上，17株ST44与1株ST323聚集成一簇，2株ST269和1株ST605聚集成一簇。

图2 24株停乳链球菌似马亚种菌株MLST聚类分析树状图Fig.2 Tree map of MLST cluster analysis of 24 Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis strains

3 讨 论

停乳链球菌属于链球菌属，根据兰氏血清分群，可分为G群(约3/4)、C群(约1/4)、A群和L群(偶尔)[2]。停乳链球菌分为停乳链球菌似马亚种(SDSE)和停乳链球菌停乳亚种(Streptococcusdysgalactiaesubspeciesdysgalactiae，SDSD)。SDSD在很大程度上被认为是一种动物病原，大多对动物致病，极少有报道人类感染的病例[17]。而SDSE是一种人兽共患病原体，近10年来，在中国、日本、韩国、美国等世界各地，由停乳链球菌似马亚种引起侵袭性感染并导致暴发播散的报道越来越多[18]。在本研究中， 16.7%的SDSE菌株分离自侵袭性感染患者，低于Loubinoux等[19]研究中的高发病率(60%)。长期以来SDSE被认为可寄居健康人咽部，但2003—2020年我国各地就陆续出现多起由SDSE引起的以上呼吸道症状为主的聚集性发热事件[2,12-13,20-22]，且在本研究中大多数的SDSE菌株(58.3%)均分离自咽部，提示该菌可能通过呼吸道传播感染咽部引起致病，需引起临床医生的注意。同时，本研究中20.8%的SDSE菌株来自皮肤，仅次于咽部，在其他已报道的研究中分离率分别为30.8%[19]和51%[23]，提示皮肤也是SDSE菌引起临床感染的重要部位。

分子流行病学研究是追踪人类和动物病原体出现和传播的重要方法[24]。M蛋白是SDSE和化脓性链球菌的主要毒力因子，由emm基因编码[25]。M蛋白通过阻止补体在细胞表面的附着从而保护细菌免受吞噬作用，编码M蛋白的基因emm中的核苷酸变异被用来在亚种水平上对SDSE和化脓性链球菌进行分型[26]。现在许多研究已将emm分型用于人类SDSE分离株的流行病学调查[19,27-28]。在我们的研究中，emm分型流行株以stCNSRT2.0、stG840.0为主，占所有SDSE分离株的79.2%，与挪威[29](stG485、stG6 和stG643为主)，日本[30-31](st6792或亚型 stG6792.3、stG485和stG2078为主)，美国[32](stG6、stG245、stG2078和stG643为主)，中国北京地区[25](stG245.0、stG652.0和stG485.0为主)都不同，故推测优势株的不同可能是由于地理位置差异造成的。本研究中咽拭子来源菌株的emm分型均为stCNSRT2.0，而其他感染来源的菌株和emm类型之间没有观察到明显的关联。Lu BH等[25]的研究结果显示在引起血液感染的分离株中，stG245.0和stG485.0是最常见的emm型，在本研究中，这2种emm类型则分布在皮肤软组织和腹水标本中，未出现在血液标本中。由于本研究的样本量较少，福建地区的优势emm分型及emm类型与感染来源的联系还有待未来更大规模的科学临床研究来验证。

多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing，MLST)是一种基于核酸序列测定的基因分型方法，它通过对多个管家基因进行测序分析，从而鉴定其位点上的遗传变异情况[15]。MLST与传统分子生物学分型方法相比，具有更高的分辨能力，能将细菌区分为更多不同的型，确定它们之间的系统发育关系及与疾病的联系，因此近年来逐渐被广泛接受和使用[33]。本研究使用MLST对24株SDSE分离株进行分型，菌株间相似度为13.9%～100%，展现出该菌具有多样性。结果显示，本研究中SDSE分离株的优势ST型是ST44，占总分离株的70.8%，在北京地区[25]临床分离的56株SDSE菌株中以ST127、ST271、ST44为流行ST型,而目前国内其他省份仍缺乏关于该菌分子分型的相关报道信息。此外，本研究中所有咽拭子标本的MLST分型均为ST44，与此同时，2013年在我国成都某医院30名医护人员暴发的集体性扁桃体咽炎事件中分离出ST44型的SDSE分离株[2]，因此推测出SDSE菌株的ST44型可能通过感染咽部引起致病，有必要提高对该种ST型的流行病学监测以达到早期预防与诊断。

ST605为本研究中新发现的型别，其他地区尚未报道。序列比对发现，ST605与ST474之间仅存在xpt位点的差异，且ST605的xpt(113)与ST474的xpt(85) 也仅有一个碱基的变异，表明ST605与ST474亲缘关系很近，此次新发现的ST605很可能是由ST474菌株变异而来的，其流行病学意义尚有待进一步观察。

目前，emm分型和MLST都是研究停乳链球菌的主要分子分型技术，能将不同实验室间的结果比对，各有优劣。前者应用广泛，系统性最强；后者分辨率高，从而进行菌株溯源和遗传进化分析[34]。在本研究中，24株SDSE菌株被分为5个emm类型和6个ST型，MLST分辨率略高于emm分型，这与Beatriz等人[16]的研究相符。本实验结果显示，83%左右的SDSE分离株具有emm分型和ST型的独特组合(stCNSRT2.0- ST44、stG485.0- ST128、stG643.0- ST269)，表明SDSE的emm分型和MLST分型具有一定的关联性，这与Yin J等人[35]的研究发现是一致的。同时，本研究也发现了emm分型stG840.0与3种遗传距离相差较远的ST型(ST127、ST323、ST605)相关联，一些研究者认为，emm基因可在β溶血性链球菌之间水平转移，有利于SDSE的emm基因发生变异[36-37]，这可能解释了本研究中emm分型和ST型不具有完全一致性的原因。有数据表明，重组是SDSE发生遗传多样化的主要机制，其发生频率是管家基因点突变的4倍[27]。由此，可推测SDSE基因中存在某些特殊的特征使它们在不同地区占优势，鉴于其人兽共患的潜力，仍需持续关注该菌的自然遗传进化。

综上所述，本研究应用两种分型技术揭示了福建地区SDSE存在的某些特定emm分型和ST型，丰富了福建省对该菌株的分子流行病学研究，将为今后探索SDSE毒力的进化和种群遗传学提供一定基础。但是本研究的SDSE菌株数量有限，且侵袭性菌株仅4株，代表性不够，不足以完全阐明该菌株的分子生物学特征，仍有待将来更多科学的、更大样本量的研究进一步验证。

利益冲突：无

引用本文格式：何放晴，李曲文，张志珊，等. 24株停乳链球菌似马亚种的分子鉴定和基因分型[J].中国人兽共患病学报，2022，38(7)：607-613. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.086