高效液相色谱法测定粮油食品中黄曲霉毒素B1含量的不确定度分析

姚 唱，王伊乔，陈 洁

北京市粮油食品检验所 (北京 100144)

黄曲霉(AFT)是毒性极强的剧毒物质，世界卫生组织癌症研究机构1993年将黄曲霉划定为一类天然存在的致癌物，其衍生物有约20种，其中以黄曲霉毒素B1的毒性最大，致癌性最强[1-2]。黄曲霉主要污染原粮、油脂及其制品[3]，如玉米、大米、花生、花生油等。国内食品检测中以黄曲霉毒素B1作为污染指标，可通过薄层层析法和高效液相色谱法检测[4]。目前，真菌毒素在社会上受到了广泛关注，真菌毒素的检测(例如黄曲霉、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素等)已成为粮食作物常检的项目之一。

测量不确定度是对于误差分析中的最新理解和阐述，是评定实验检测结果质量的指标，同时也是该结果可信赖程度的重要评价指标。CNAL发布专项文件，指出实验室应为不确定度的测量构建配套的评定程序，而且对于测定获得数据开展评定[5]。在本文实验中，依据JJF 1059.1—2012的要求，运用高效液相色谱法进行测定的过程中，确认不确定度的核心影响因素，并对此展开分析，尽可能保障检测数据的精准与真实。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

乙腈，色谱纯，美国赛默飞公司；甲醇，色谱纯，美国赛默飞公司；黄曲霉毒素B1标准品，108.3 ng/mL，1 mL/支，德国默克公司；超纯水等。

分析天平(分度值0.01 g)，奥豪斯仪器公司；N-EVAP 111型氮吹仪，美国Orgnamation公司；MS 3型涡旋振荡器，德国艾卡公司；高效液相色谱仪，日本岛津公司生产，检测器型号为RF-20A。

1.2 方法

1.2.1样品前处理

参照GB 5009.22—2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》第三法高效液相色谱-柱后衍生法中规定的前处理方法。

1.2.2色谱条件

色谱柱，ODS-SP C18(柱长150 mm，内径4.6 mm，填料粒径5 μm)；流速1.0 mL/min；进样量50 μL；柱温40 ℃；光化学柱后衍生器；检测器波长，激发波长360 nm，发射波长440 nm；流动相，乙腈、甲醇、水的体积比为16∶16∶68。

1.2.3数学模型

式中：X为样品中黄曲霉毒素B1含量的数值，μg/kg；A为进样溶液中黄曲霉毒素B1含量的浓度，ng/mL；V为定容体积，mL；M为样品质量的数值，g；f为稀释倍数。

在此次研究过程中，综合JJF 1059.1—2012所介绍的具体操作思路，总结此次分析的不确定度，主要有标准溶液、称量等多个来源，本试验对不同来源进行评定与分析。

2 结果与讨论

2.1 不确定度分量的评定

2.1.1标准溶液引入的不确定度

2.1.1.1 标准物质引入的不确定度

在此次实验过程中，实际采购的标准溶液偏差数据是±1.51 ng/mL，浓度数据是108.3 ng/mL，包含因子k=3，结合前述数据可得出其相对不确定度为：

2.1.1.2 玻璃量具引入的不确定度

由玻璃量具引入的不确定度有两类：一类是量具的生产校准过程中所引入的；另一类是由于量具的使用温度与标准温度不一致，导致液体膨胀而引入的。

表1 玻璃量具的不确定度

由玻璃量具引入的相对不确定度为：

2.1.1.3 标准曲线校正引入的不确定度

将配制好的黄曲霉毒素B1标准曲线上机测定，测定结果见表2。

表2 标准曲线测定结果

根据表2拟合得出黄曲霉毒素B1的标准工作曲线为：y=99 950.859 6x+2 696.983 4，线性相关系数r为0.999 7，式中：y表示峰面积；x表示浓度，ng/mL。对标准曲线数据进行分析，分析结果见表3。

表3 标准曲线数据分析结果

由此计算得出：

2.1.1.4 标准溶液引入不确定度的合成

结合前文所介绍的三类不确定分量，可计算出由标准溶液引入的不确定度为：

2.1.2样品称量引入的不确定度

在进行称量的场景中，产生的相对标准不确定度(操作中具体的样品量为5.00 g)为：

2.1.3体积引入的不确定度

由体积引入的不确定度主要包括稀释因子和最终定容体积。稀释因子产生的不确定度是由实验过程中所涉及的一系列稀释过程所产生的，而过程中所有的稀释步骤都需摇匀，所以液体分配不均产生的不确定度可以忽略不计。因为在进行稀释操作的过程中，要求运用多类规格的量具，故稀释产生的不确定度主要是由玻璃量具引入的；最后定容体积所产生的影响，即多种批次定容标线的划定与制作工艺的区别所产生的影响。按照对玻璃量具引入的不确定度进行评定，见表4。

由玻璃量具引入的相对不确定度为：

2.1.4样品提取过程引入的不确定度

在进行样品提取的过程中，主要有相关样品的称量、均质等多个程序，其各个操作流程都会带来影响，对于该类不确定度，可依靠测试整个实验场景的具体回收率参数开展针对性的评定工作，最终所获得的结果详见下表5所述。

表4 玻璃量具的不确定度

表5 实验回收率测定结果

由表5中数据计算得出不确定度为：

相对标准不确定度为：

2.1.5测量的重复性引入的不确定度

对同一样品进行6次平行测定，结果见表6。

表6 样品的测定结果

结合表6所述的信息，来源于测量重复性的不确定度数据为：

相对标准不确定度为：

2.2 相对标准不确定度的合成及扩展

2.2.1标准不确定度的合成

结合所获得不确定度分量的数据，进行相关数据的汇总，最终所获得的数据详见表7所述。

表7 相对标准不确定度分量

根据表7中数据，合成标准不确定度为：

2.2.2扩展不确定度的评定

按照惯例，测量结果的扩展不确定度包含因子k=2，计算可得相对扩展不确定度U=urel(c)×k=0.028 23×2=0.056 46。

样品中黄曲霉毒素B1的最佳估计值为1.064 287 μg/kg，因此其扩展不确定度为U=1.064 287 μg/kg×0.056 46≈0.060 1 μg/kg。

3 结论

本试验不确定度的主要影响因素是测量的重复性，其次是标准曲线校正以及样品处理过程引起的，而由标准物质和样品称量等引起的不确定度很小，可忽略不计。 为减小不确定度，样品提取过程要更规范，以减少黄曲霉毒素B1在前处理过程中的损失。 样品每次称量前都要充分混合均匀，提取液现用现配，样液经免疫亲和柱净化时要严格控制洗脱流速，其次要注意对标准溶液进行低温密封保存，同时配制、定容过程要选用更高精度的量具，并增加平行实验次数，通过这些操作可以进一步减小不确定度。