基于体内药效学结合网络药理学的丝穗金粟兰抗炎镇痛作用研究△

卢显兴，奉建芳，2，丘琴，2*，黄秋艳，陈玉敏

1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；

2.广西优势中成药与民族药开发工程技术研究中心，广西 南宁 530200

丝穗金粟兰Chloranthus fortunei（A.Gray）Solms-Laub 为金粟兰科金粟兰属植物，俗称剪草、翦草、四块瓦，为我国瑶族常用药材，多以全草入药，具有活血止痛、祛风除湿的功效；临床常用于风湿性关节炎、急性肠胃炎、咳嗽、跌打肿痛等；主要分布在广西、江苏、浙江、江西、湖南、贵州等地[1-2]。目前，对丝穗金粟兰的研究内容主要侧重于化学成分研究，其体内抗炎镇痛药效作用及机制尚未见文献报道。网络药理学可以构建疾病-药物相互作用网络，揭示药物与疾病的关联，从整体研究药物与疾病的关系，目前已广泛应用于中药领域的研究[3-4]。本实验研究丝穗金粟兰水提物的体内抗炎镇痛作用，并利用网络药理学方法对其作用机制进行预测分析，为其后期开发提供参考。

1 材料

1.1 试药

丝穗金粟兰药材采自广西金秀瑶族自治县桐木镇，经广西中医药大学朱意麟实验师鉴定为金粟兰科金粟兰属植物丝穗金粟兰Chloranthus fortunei（A.Gray）Solms-Laub；醋酸地塞米松（浙江仙琚制药股份有限公司，批号：20305）；罗通定（四川迪菲特药业有限公司，批号：200601）；角叉菜胶（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10207866）；二甲苯（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110613，分析纯）；冰乙酸（天津市富宇精细化工有限公司，批号：20200722，分析纯）；蒸馏水为实验室自制。

1.2 仪器

Simplicity 型超纯水系统（密理博中国有限公司）；DHG-9203A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；SQP 型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；RB-200 型智能热板仪（成都太盟软件有限公司）。

1.3 实验动物

SPF级昆明种（KM）小鼠，150只，雌雄各半，体质量18～22 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004；饲养于广西中医药大学实验动物中心，自由饮水摄食3 d。动物实验方案由广西中医药大学伦理委员会审定，符合国家实验动物福利伦理的相关规定，审批号为DW20201025-137。

2 方法

2.1 丝穗金粟兰水提物抗炎镇痛作用体内研究

2.1.1水提物制备 取丝穗金粟兰干品，剪碎成长约1 cm，称取500 g，用10 倍量蒸馏水浸泡30 min，回流提取2 次，每次1.5 h，用医疗纱布滤过，合并2 次滤液并浓缩成浸膏。用蒸馏水100 mL 溶解，配成0.5 g·mL-1（以生药量计）的粗提物为药液备用。

2.1.2小鼠耳肿胀实验 参考文献[5]方法，取KM小鼠50只，体质量18～22 g，随机分组，每组10只，雌雄各半。分别设模型组（灌胃等体积蒸馏水），阳性药地塞米松组（6 mg·kg-1），丝穗金粟兰水提物高、中、低剂量（7.28、3.64、1.82 g·kg-1，以生药量计）组。给药体积为20 mL·kg-1，每日1 次，连续给药7 d。末次给药45 min后，于小鼠右耳廓前后均匀涂擦二甲苯30 μL，致炎30 min 后，将小鼠颈椎脱臼处死。沿耳廓基线剪下双耳，用直径6 mm打孔器分别在双耳同一部位打下圆耳片，以左、右耳片质量之差作为肿胀度。

2.1.3小鼠足肿胀实验 参考文献[6]方法，动物分组及给药同2.1.2 项下方法，于末次给药30 min后，在每只小鼠左后肢足跖皮下注射1%角叉菜胶的0.9%氯化钠溶液0.05 mL。于致炎后2 h 处死小鼠，从踝关节处剪下左、右后足，于万分之一天平上称定质量，以左、右后足质量之差作为肿胀度。

2.1.4乙酸致小鼠扭体实验 参考文献[7]方法，动物分组及给药同2.1.2项下方法，阳性组换为罗通定54.6 mg·kg-1，末次给药后1 h后，腹腔注射0.6%乙酸溶液（10 mL·kg-1），记录15 min 内小鼠扭体次数。

2.1.5数据分析 采用SPSS 17.0，数据以（）表示。多组间比较采用One-way ANOVA分析，给药组与模型组比较，方差齐，采用最小显著差数法（LSD）分析，方差不齐采用Dunnett′s T3 法分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.2 丝穗金粟兰抗炎镇痛作用的网络药理学研究

2.2.1丝穗金粟兰抗炎镇痛靶点数据库的建立 通过文献查阅得到现阶段丝穗金粟兰中已发现的化合物，利用PubChem 平台（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取其3D 结构信息，将其导入SwissADME（http://www.swissadme.ch）进行药动学研究。以满足Lipinski规则中至少3项和GI absorption为“High”作为筛选标准，筛选出丝穗金粟兰中与抗炎镇痛关联的成分，通过SwissTargetPrediction 平台（http://www.swisstargetprediction.ch）预测成分潜在的作用靶标，使用UniProt 数据库（https://www.uniprot.org）进行校正后作为候选靶标。在GeneCards 数据库（https://www.genecards.org）以“pain”和“inflammation”为关键词进行检索，获得疾病靶点，采用韦恩分析获取潜在的丝穗金粟兰镇痛抗炎靶点。

2.2.2成分-靶点-抗炎镇痛相互作用网络的构建与分析 利用STRING 平台（https://www.string-db.org）探寻丝穗金粟兰抗炎镇痛潜在靶点蛋白之间的关系，以蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络信息为桥梁，通过Cytocape 3.7.0软件及插件Merge功能将丝穗金粟兰潜在抗炎镇痛靶点PPI 信息，活性成分靶点信息进行关联，构建丝穗金粟兰活性成分-镇痛抗炎可视化网络，利用插件cytoHubb 筛选出网络中核心靶点。

2.2.3抗炎镇痛通路富集分析 将2.2.2 项下获取的潜在镇痛抗炎靶点导入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov）进行通路富集分析，筛选条件为“Homo sapien”“P＜0.05”。

2.2.4关键成分与靶点的分子对接 选取在2.2.3项下网络中度值较高5个核心靶点，从RCSB数据库（http://www1.rcsb.org/）下载蛋白的3D 结构，利用PyMol软件进行受体处理（去水分子、加氢等），利用AutoDock Vina与其对应的成分进行分子对接。

3 结果

3.1 丝穗金粟兰水提物对小鼠的抗炎镇痛作用

与模型组比较，丝穗金粟兰水提物3 个剂量组和阳性药地塞米松组小鼠耳廓肿胀度显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组比较，丝穗金粟兰水提物中、高剂量组和阳性药地塞米松组小鼠足肿胀度显著降低（P＜0.05，P＜0.01），见表1。与模型组比较，丝穗金粟兰水提物3个剂量组和阳性药罗通定组小鼠扭体次数显著减少（P＜0.05，P＜0.01），见表2。

表1 丝穗金粟兰水提物对小鼠耳廓肿胀和足肿胀的影响（, n=10）

表1 丝穗金粟兰水提物对小鼠耳廓肿胀和足肿胀的影响（, n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；表2同。

表2 丝穗金粟兰水提物对小鼠扭体次数的影响（, n=10）

表2 丝穗金粟兰水提物对小鼠扭体次数的影响（, n=10）

3.2 丝穗金粟兰抗炎镇痛活性成分预测及靶点的筛选

基于参考文献[8-13]，共获取46 个符合筛选原则的丝穗金粟兰活性成分，其相关药动学评价结果见表3。

通过SwissTargetPrediction 平台预测到604 个成分靶点。在GeneCards 平台筛选得到抗炎镇痛相关疾病靶点，按Score 值由大到小排列，分别选择前500 个作为后续研究靶点。利用韦恩图将活性成分预测靶点和疾病靶点取交集，获取得到丝穗金粟兰抗炎镇痛相关的40个潜在靶点数据集，见图1。

图1 疾病靶点与丝穗金粟兰成分靶点韦恩图

3.3 成分-靶点-抗炎镇痛网络的构建与分析

将上述获取得到的40 个潜在抗炎镇痛靶点导入STRING 数据库分析，利用Cytocape 3.7.0 构建成分-靶点-抗炎镇痛网络，分别利用插件cytoHubb 筛选出该网络中核心靶点，见图2。

图2 丝穗金粟兰的活性成分-靶点-疾病网络

结果显示，丝穗金粟兰中有31 个成分涉及的40个靶点可能与疼痛和炎症存在联系。其中前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、基质金属蛋白酶-9（MMP9）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、信号传导与转录激活因子3（STAT3）、白蛋白（ALB）在网络中度值较大，可能是其发挥抗炎镇痛作用的关键靶点。该网络存在1个成分关联多个靶点，1个靶点关联多个成分的情况，说明丝穗金粟兰的抗炎镇痛作用是基于多成分多靶点的相互作用产生，见表4。

表4 丝穗金粟兰抗炎镇痛网络的主要成分及靶点

3.4 丝穗金粟兰抗炎镇痛通路富集分析

KEGG 富集分析结果显示，丝穗金粟兰抗炎镇痛可能与肿瘤坏死因子（TNF）、核转录因子-κB（NF-κB）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）等62 条通路密切相关（P＜0.05），显著性最高的前20条通路见图3。

图3 丝穗金粟兰抗炎镇痛潜在靶点KEGG通路富集分析

3.5 丝穗金粟兰抗炎镇痛主要活性成分与核心靶点对接结果

将筛选出丝穗金粟兰抗炎镇痛活性成分-靶点-抗炎镇痛网络中度值较高5 个核心靶点PTGS2、MMP9、MAPK1、STAT3、ALB 与其对应的成分进行分子对接处理。结合活性与对接得分成正比，对接结果表明，其中乙酸松油酯、银线草醇I 与PTGS2，金粟兰内酯与MAPK1，丝穗金粟兰内酯与MMP9，卡瓦胡椒素A 与ALB 结合活性相对较高，见表5和图4。

图4 丝穗金粟兰抗炎镇痛主要活性成分与核心靶点分子对接模式图

表5 核心靶点与对应化合物结合活性得分

4 讨论

药理实验结果显示，丝穗金粟兰水提物可显著抑制二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶引起的小鼠足肿胀及乙酸所致小鼠疼痛扭体次数，提示丝穗金粟兰水提物具有一定的抗炎镇痛作用。

网络预测分析表明，丝穗金粟兰抗炎镇痛的主要物质基础可能为β-榄香醇、莽草酸、银线草醇E、银线草醇I 等成分。通过PPI 网络分析筛选出PTGS2、MMP9、MAPK1、STAT3、ALB 等40 个可能在丝穗金粟兰治疗炎症和疼痛性疾病过程中发挥重要作用的关键靶标及334 条炎症与疼痛交集靶点作用关系。

为进一步研究丝穗金粟兰抗炎镇痛的潜在机制，利用筛选出的46 个活性成分与抗炎镇痛的交集靶点进行了通路富集分析。其中TNF 信号通路、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、Toll 样受体（TLR）信号通路、NF-κB 信号通路、MAPK 信号通路显著性较高。TNF 是一种促炎细胞因子，可通过调节细胞因子的产生、细胞存活和细胞死亡来协调组织稳态，TNF 的急剧增加可导致疾病发作，研究表明通过调控TNF 信号通路能够发挥抗炎镇痛的作用[14]。NF-κB 信号通路是治疗炎症关键通路，研究表明疼痛、发热、水肿等炎症反应与炎症因子的异常表达有关，通过抑制该通路的活化可以达到治疗该类疾病的效果[15-16]。免疫系统的细胞表达存在各种模式识别受体（PRR），这些受体是借助识别特定的病原体相关分子模式（PAMP）来检测危险并发出特定的免疫反应，在清除病原体时会存在无法区分“自身”和“非自身”分子。TLR 是最显著的PRR，其在对病原体的感应时会引起炎症反应。TLR 拮抗剂的开发是目前免疫疾病研究的热点[17-18]。本研究发现40个潜在靶点中有6 个富集在TLR 信号通路上，分别为凋亡相关半胱氨酸蛋白酶8（CASP8）、PIK3CA、MAPK1、TNF、TLR4、V-REL 网状内皮增生病毒癌基因同源物A（RELA），可能为丝穗金粟兰调控该通路的关键靶点。

分子对接结果显示丝穗金粟兰抗炎镇痛潜在靶点蛋白与相应配体化合物的结合活性良好，其中酸松油酯、银线草醇I 与PTGS2、金粟兰内酯与MAPK1、丝穗金粟兰内酯与MMP9、卡瓦胡椒素A与ALB 结合活性相对较高，本次筛选出的核心靶点中PTGS2 的度值最高，极有可能是该植物抗炎镇痛的关键节点。前列腺素在炎症中起调节作用，环氧合酶是催化花生四烯酸代谢和前列腺素合成的初始步骤，是炎症的主要介质，PTGS2 主要在炎症细胞中表达，并在慢性和急性炎症中明显上调，成为许多药理抑制剂的关键靶标[19]。MAPK1 可以通过磷酸化转录因子改变基因表达，从而促进炎症因子产生巨噬细胞，进而参与抗炎作用[20]。因此，这2个靶点可能是丝穗金粟兰抗炎镇痛的关键靶点。

5 结论

丝穗金粟兰水提物具有抗炎镇痛作用，丝穗金粟兰可能是通过β-榄香醇、莽草酸、银线草醇E、银线草醇I 等活性成分通过靶向PTGS2、MMP9、MAPK1、STAT3、ALB进而调控TNF、HIF-1、TLR、NF-κB、MAPK信号通路发挥抗炎镇痛作用。