宽体金线蛭仿生酶解液物质基础分析△

董萍萍，王常瞵，刘国飞，王红，李华健，张加余，王少平*，代龙*

1.滨州医学院 药学院，山东 烟台 264003；

2.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250300

宽体金线蛭是当前药材市场流通和临床应用的主流品种，味咸、苦，性平，归肝经，为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigraWhitman 的干燥全体，具有破血逐瘀的功效[1]。宽体金线蛭临床多用于治疗脑血管疾病[2-3]、冠心病、心绞痛[4]、中风偏瘫[5-6]等。动物药具有成分复杂、药效物质基础不明确等特点。目前，大多数动物类中药的鉴别主要依靠性状、显微及理化鉴别方法，含量测定项也大多以直接测定蛋白质、多糖含量进行质量控制，质量控制方法缺乏全面性、针对性和专属性，这也是构建和完善动物药材质量评价体系的难点和重点之一。

宽体金线蛭具有较强的抗凝活性，本课题组前期实验建立了其体外仿生酶解工艺，对宽体金线蛭仿生酶解液的体外抗凝活性进行研究，发现其能产生较强的抗凝活性[7]。然而，在经过体内口服给药或体外仿生酶解后，多肽及大分子类物质被消化，目前宽体金线蛭物质基础仍不明确，因此利用化学分析及光谱分析等手段，对其进行固形物、无机盐、肽、氨基酸含量测定，核苷特征图谱及肽特征图谱研究，从化学定性和定量的角度对宽体金线蛭仿生酶解液进行物质基础研究。同时，从生物活性肽的角度对宽体金线蛭仿生酶解液进行质量控制研究，能够保证其质量可控性和一致性。

1 材料

1.1 仪器

PHS-25型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；AL-204型万分之一电子天平、XS105型十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；TDL-5-A型离心机（上海安亭科学仪器厂）；DDS-11A型电导率仪（上海佑科仪器仪表有限公司）；L-8900型全自动氨基酸分析仪（日本日立公司）；LC-20AT型高效液相色谱仪（CLASS-VP工作站）、UV-1800型紫外-可见分光光度计均购于日本岛津株式会社。

1.2 试药

采集包含道地产区（山东省济宁市）、主产区（江苏省如皋市、浙江省平湖市）3个产地的15批宽体金线蛭药材（S1～S15），经济南市药品检验所主任药师宋希贵鉴定为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigraWhitman 的全体，经检验均符合《中华人民共和国药典》2020年版水蛭项下的各项规定。

对照品木犀草苷（批号：111720-201810）、次黄嘌呤（批号：140661-201704）、尿嘧啶（批号：100469-201302）、尿苷（批号：110887-201803）、黄嘌呤（批号：140662-200802）均购于中国食品药品检定研究院，纯度均≥98%；胰蛋白酶（批号：20190616，国药集团化学试剂有限公司）；胃蛋白酶（批号：RH156275，上海易恩化学技术有限公司）；牛血清白蛋白（批号：E1905152）、三氟乙酸（TFA，批号：L1803213）均购自阿拉丁试剂有限公司；福林酚（批号：S07D9J77046，上海源叶生物科技有限公司）；100 Da 即用型透析袋（批号：131057-2008，北京瑞达恒辉科技发展有限公司）；硫酸铜、酒石酸钾、盐酸、氢氧化钠、氯化钠等试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。

2 方法

2.1 含量测定

2.1.1供试品溶液的制备 精密称取宽体金线蛭粉末2.0 g（过五号筛），加入去离子水20 mL，称定质量，煮沸10 min，补足减失质量，冷却至40 ℃后用稀盐酸调节pH 为2，加入酶底比1%的胃蛋白酶，40 ℃酶解1 h 后用氢氧化钠溶液调节pH 至8，加入酶底比1%的胰蛋白酶于40 ℃下继续酶解3 h，煮沸10 min杀酶，然后将酶解液调至中性，5000 r·min-1离心10 min（离心半径为10 cm）后取上清液，残渣加水洗涤2～3 次后同样条件离心，合并上清液，定容至20 mL，得到生药质量浓度为0.1 g·mL-1的仿生酶解液。

2.1.2固形物含量测定 精密量取15 批仿生酶解液20 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量。

2.1.3无机盐含量测定 精密称取无水氯化钠0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 g，分别加入去离子水100 mL 充分溶解，采用电导仪测定7 份不同质量浓度标准溶液的电导率（σ）。以σ（mS·cm-1）为纵坐标（Y），盐质量浓度（mg·mL-1）为横坐标（X）绘制标准曲线，用电导仪测定15 批仿生酶解液的σ值，代入标准曲线计算含盐量。

2.1.4肽含量测定

2.1.4.1对照品溶液的制备 精密称取牛血清白蛋白15 mg，加去离子水溶解，定容至50 mL，即得。

2.1.4.2碱性铜试液的制备 精密称取氢氧化钠10 g、碳酸钠50 g，加去离子水400 mL 溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5 g，加去离子水50 mL，另取硫酸铜0.25 g，加去离子水30 mL，将两液混合作为乙液。使用时合并甲液和乙液，加去离子水定容至500 mL即得。

2.1.4.3福林酚试液的制备 取1 mol·L-1福林酚试剂1 mL，加去离子水至8 mL，即得。

2.1.4.4标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于0～5 号具塞试管中，各加去离子水至1.0 mL，再分别加入碱性铜试液1.0 mL 和福林酚试液4.0 mL，立即混匀，置55 ℃水浴中反应5 min 后取出，置冷水浴中冷却10 min。以0 号管为空白，在650 nm 处迅速测定吸光度（A）。以A为纵坐标（Y），牛血清白蛋白含量为横坐标（X）绘制标准曲线，并计算线性回归方程。

2.1.4.5供试品测定 精密量取15 批仿生酶解液各1.0 mL，按2.1.4.4 项下自“加入碱性铜试液1.0 mL”起，依法测定A，代入回归方程计算肽含量。

2.1.5氨基酸含量测定 仿生酶解提取液利用100 Da透析袋进行样品脱盐处理后，利用氨基酸分析仪分析[8]，得到酶解液中游离氨基酸的含量；仿生酶解提取液进行样品脱盐处理后，加入6 mol·L-1盐酸溶剂，在减压条件下将水解管密封后放入烘箱，在110 ℃水解24 h，冷却，过滤水解液后旋蒸去除盐酸，利用氨基酸分析仪分析，得总氨基酸含量。

2.2 核苷特征图谱

2.2.1色谱条件 COSMOSIL 5C18-PAQ 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（1∶99），等度洗脱35 min；流速为0.8 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为254 nm[9-10]。

2.2.2对照品溶液的制备 分别取对照品次黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷、黄嘌呤适量，精密称定，分别加去离子水制成质量浓度分别为12.0、1.5、4.5、100.0µg·mL-1的对照品溶液。

2.2.3方法学考察

2.2.3.1精密度考察 取供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件连续进样6次，统计4个峰的保留时间和峰面积，选择峰形较好、峰面积较大的2 号峰（次黄嘌呤）为S 峰[11]，计算15批药材各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。

2.2.3.2稳定性考察 取供试品溶液，在供试品溶液制备完成的第0、4、8、12、18、24 小时分别进样测定，统计4个峰的保留时间和峰面积，以2号峰（次黄嘌呤）为S 峰，计算各峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。

2.2.3.3重复性考察 取平行制备的6 份供试品溶液，分别进样测定，统计4 个峰的保留时间和峰面积，以2号峰（次黄嘌呤）为S峰，计算各峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。

2.2.4建立宽体金线蛭仿生酶解液核苷特征图谱 精密吸取供试品溶液5µL，分别进样测定，记录35 min的色谱图。根据15 批宽体金线蛭酶解液测定结果所显示的峰个数、相对保留时间和相对峰面积等相关参数，以2 号峰（次黄嘌呤）为S 峰，计算15 批酶解液各峰的相对保留时间，建立宽体金线蛭仿生酶解液核苷特征图谱。

2.3 肽特征图谱

2.3.1色谱条件 YMC-Pack PROTEIN-RP 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.5%TFA 水溶液（A）和0.5%TFA 乙腈溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，99%A；10～60 min，99%～75%A；60～65 min，75%～99%A；65～70min，99%A）；流速为1.0mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为254 nm。

2.3.2对照品溶液的制备 取对照品木犀草苷适量，精密称定，加去离子水制成质量浓度为0.2mg·mL-1的木犀草苷溶液，精密量取木犀草苷溶液1 mL置于10 mL量瓶中，加水定容至刻度，混匀，过0.45 µm 微孔滤膜，即得。

2.3.3方法学考察

2.3.3.1精密度考察 取供试品溶液，按照2.3.1项下色谱条件连续进样6次，统计6个峰的保留时间和峰面积，选择峰形较好、峰面积较大的5 号峰（木犀草苷）为S 峰，计算各峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。

2.3.3.2稳定性考察 取供试品溶液，在供试品溶液制备完成的第0、4、8、12、18、24 小时分别进样测定，统计6个峰的保留时间和峰面积，以5号峰（木犀草苷）为S 峰，计算各峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。

2.3.3.3重复性考察 取平行制备的6 份供试品溶液，分别进样测定，统计6 个峰的保留时间和峰面积，以5号峰（木犀草苷）为S峰，计算各峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。

2.3.4建立宽体金线蛭仿生酶解液肽特征图谱 取15批酶解液样品，精密吸取10µL分别进样测定，记录70 min 的色谱图。根据测定结果中峰个数、相对保留时间和相对峰面积等相关参数，以峰形较好、峰面积较大的5 号峰（木犀草苷）为S 峰，计算15批药材各峰的相对保留时间，建立宽体金线蛭仿生酶解液肽特征图谱。

3 结果

3.1 含量测定结果

3.1.1固形物含量测定结果 由表1可知，宽体金线蛭仿生酶解液的固形物质量浓度为76.3～78.5mg·mL-1，平均值为77.6 mg·mL-1，以（± 3s）为固形物含量波动限度，故拟定宽体金线蛭仿生酶解液固形物质量浓度的测定范围为75.5～79.7 mg·mL-1。

表1 15批宽体金线蛭仿生酶解液质量浓度

3.1.2无机盐含量测定结果 电导率和盐质量浓度之间存在线性关系，线性方程为Y=1.177 2X+0.227 3（r=0.999 5），线性结果良好。

由表1可知，宽体金线蛭仿生酶解液的无机盐质量浓度为11.2～12.3 mg·mL-1，平均值为11.7 mg·mL-1，以（± 3s）为含量波动限度，则宽体金线蛭仿生酶解液无机盐质量浓度测定范围为10.7～12.7 mg·mL-1。

3.1.3肽含量测定结果 牛血清白蛋白含量与A之间存在线性关系，线性回归方程为Y=2.694 3X+0.010 5（r=0.999 6），线性结果良好。

由表1结果可知，宽体金线蛭仿生酶解液的肽质量浓度为44.3～47.3 mg·mL-1，平均值为46.0 mg·mL-1，以（± 3s）为含量波动限度，则拟定宽体金线蛭仿生酶解液肽质量浓度测定范围为42.6～49.4 mg·mL-1。

3.1.4氨基酸含量测定 由表1结果可知，宽体金线蛭仿生酶解液的游离氨基酸质量浓度为2.2～2.8mg·mL-1，平均值为2.5 mg·mL-1，以（± 3s）为含量波动限度，则宽体金线蛭仿生酶解液游离氨基酸质量浓度测定范围为1.9～3.1 mg·mL-1。总氨基酸质量浓度为49.8～51.0 mg·mL-1，平均值为50.5 mg·mL-1，以（± 3s）为含量波动限度，则宽体金线蛭仿生酶解液总氨基酸质量浓度测定范围为49.4～51.6 mg·mL-1。

3.2 核苷特征图谱

3.2.1特征峰的指认 根据仿生酶解液样品S1与各核苷对照品的特征图谱指认各特征峰，结果见图1。

3.2.2方法学考察结果 精密度考察结果显示，各峰的相对保留时间的RSD 均小于1%，相对峰面积的RSD 均小于5%，表明仪器精密度良好；稳定性结果显示，各峰的相对保留时间的RSD 均小于1%，相对峰面积的RSD 均小于5%，表明供试品溶液在制备完成后的24 h内稳定性良好；重复性结果显示，各峰的相对保留时间的RSD 均小于1%，相对峰面积的RSD 均小于5%，表明本特征图谱测定方法的重复性良好。

3.2.3建立宽体金线蛭仿生酶解液核苷特征图谱 15批酶解液（S1～S15）的核苷特征图谱见图2，特征峰相对保留时间见表2。各峰相对保留时间的RSD均小于1%，说明宽体金线蛭酶解液批间关键成分一致，供试品色谱中呈现出4个特征峰，4个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应，其中，与次黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S 峰，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间[规定值为0.68（峰1）、1.00（峰S）、1.05（峰3）、1.26（峰4）]，其相对保留时间应在平均值±10%范围之内。

图2 15批宽体金线蛭仿生酶解液核苷特征图谱

表2 15批宽体金线蛭仿生酶解液核苷特征图谱特征峰相对保留时间

3.3 肽特征图谱

3.3.1特征峰的指认 由图3 可知，仿生酶解液样品中共有6个特征峰，其中峰5为内参物木犀草苷。

图3 仿生酶解液样品（S1）与木犀草苷对照品特征图谱

3.3.2方法学考察结果 精密度考察结果显示，各峰的相对保留时间的RSD 均小于1%，相对峰面积的RSD 均小于5%，表明仪器精密度良好；稳定性结果显示，各峰的相对保留时间的RSD 均小于1%，相对峰面积的RSD 均小于5%，表明供试品溶液在制备完成后的24 h内稳定性良好；重复性结果显示，各峰的相对保留时间的RSD 均小于1%，相对峰面积的RSD 均小于5%，表明本特征图谱测定方法的重复性良好。

3.3.3建立宽体金线蛭仿生酶解液肽特征图谱 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”（2012版）进行评价，将15 批（S1～S15）宽体金线蛭仿生酶解液肽谱导入系统，生成肽特征图谱（图4）和肽对照特征图谱（图5），标定6 个共有色谱峰，通过与对照品色谱图比较，确认5号峰为木犀草苷。

图4 15批宽体金线蛭仿生酶解液肽特征图谱

图5 15批宽体金线蛭仿生酶解液肽对照特征图谱

由表3 可知，供试品色谱中应呈现6 个特征峰，与木犀草苷参照物峰相对应的峰为S 峰，计算其余各特征峰与S 峰的相对保留时间，其相对保留时间应在平均值±10%范围之内。

表3 15批宽体金线蛭仿生酶解液肽特征图谱特征峰相对保留时间

4 讨论

通过测定15 批宽体金线蛭仿生酶解液的固形物、无机盐、肽、氨基酸质量浓度，并拟定酶解液中各物质质量浓度测定范围，从化学定量的角度对宽体金线蛭进行质量控制。

由固形物含量测定可知，宽体金线蛭经过仿生酶解后得膏率平均值为77.6%，与本课题组前期实验[12]采用的水煎煮等其他提取方式相比，药材利用率明显提高。无机盐含量测定结果显示，其在酶解液中质量浓度平均值为11.7 mg·mL-1。无机盐来源主要为宽体金线蛭药材自身所含有的盐分及酶解时调节pH所带入的盐分。酶解液中肽平均质量浓度为46.0 mg·mL-1，固形物平均质量浓度为77.6 mg·mL-1，肽含量占固形物含量的比例为59.28%。氨基酸含量测定结果表明，宽体金线蛭仿生酶解液中游离氨基酸含量占固形物3.22%，总氨基酸含量占固形物65.08%，因此固形物中61.86%为肽（总氨基酸量-游离氨基酸量），与肽含量测定的结果基本吻合。

核苷类成分是生物细胞维持生命活动的基本组成元素，参与DNA 代谢过程，次黄嘌呤是水蛭药材中的主要核苷类成分，是发挥平喘作用的主要有效成分之一，具有扩张支气管、对抗组胺及毛果芸香碱引起的支气管收缩的作用[13-14]，其性质稳定、含量较高、较容易获得且出峰时间适中，因此选择次黄嘌呤作为内标物。由于流动相系统中水相所占的比例较大，为保护色谱柱，采用亲水柱COSMOSIL 5C18-PAQ色谱柱，而非普通C18色谱柱。

由于宽体金线蛭仿生酶解液中尚未明确特定的成分，因此无法准确指认出S 峰，只能通过外加内标物作为S 峰来计算相对保留时间，从而建立特征图谱。本课题组实验前期首先以与仿生酶解液中成分相类似的肽类、氨基酸等为内标物，但经过实验发现，奥曲肽、L-甘-甘-甘三肽、脯氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸等在254 nm 均无色谱峰出现，选择带有苯环的氨基酸，如色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸进行实验，三者在254 nm 虽有吸收峰，但是保留时间太短，不适合作为S 峰。经实验发现，木犀草苷在该色谱条件下具有较强的吸收峰，且出峰时间适中，分离度良好，适合作为内标物加入到酶解液中。本研究建立的方法主要针对酶解液的主成分——肽类物质，具有稳定性好、重复性好、精密度高、特征性强的特点，能够较好地对宽体金线蛭仿生酶解液肽类物质进行质量控制，可以作为宽体金线蛭定性鉴别的重要手段之一，为宽体金线蛭的品质鉴定提供参考。