lncRNAs H19 在糖尿病骨关节炎软骨下骨中的表达及其意义

薛 伟 康少英 郭洪生 王培霞 王振兴 詹金华 张英民 王华军

1.河北省邯郸市中心医院骨三科，河北邯郸 056001；2.暨南大学第一临床医学院 暨南大学附属第一医院骨关节与运动医学中心，广东广州 510630

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退变、软骨下骨重塑为特征的退行性疾病[1-3]。代谢综合征与OA 密切相关，我国糖尿病患者人数预计到2035 年将增加到1.43 亿[4]。糖尿病患者患有OA 的概率是非糖尿病患者的3.8 倍[5]，但糖尿病对于OA 的影响机制仍然未知。长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）在多种疾病的发生和发展中起到了重要调控作用[6-8]。有研究证明lncRNAs H19 参与软骨下骨成骨分化和骨再生的调控过程[9-10]。同时，有研究证明糖尿病会导致H19 的表达异常[11]，因此阐明H19 在糖尿病OA 中的异常表达及其对软骨下骨造成的影响，为临床治疗糖尿病OA 提供理论基础和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取2017 年1 月至2019 年6 月于河北省邯郸市中心医院就诊行膝关节置换术治疗的糖尿病OA患者（DM-OA 组）与非糖尿病OA 患者（OA 组），各3 例，以及对照组3 名（同期体检）。样本均取自胫骨平台病变部位软骨下骨。OA 诊断按照Kellgren &Lawrence[12]分级为Ⅲ级或Ⅳ级，所有患者年龄50～80 岁。取样符合河北省邯郸市中心医院医学伦理委员会标准并得到了批准，且取样获得患者或家属的知情同意。

1.2 获取软骨下骨

取得胫骨平台标本后，冲洗标本，并在装有青霉素-链霉素-两性霉素B 混合溶液（三抗）（购自北京谨明生物科技有限公司，PS0752）的磷酸盐缓冲液的无菌平皿中浸泡10 min，2～3 次。将标本上表面的软骨清理干净，获得的即是软骨下骨标本。

1.3 qRT-PCR 检测lncRNAs 及miRNA 表达水平

为检测lncRNAs H19 及miR-141、miR-22 表达水平，合成对应的探针引物进行qRT-PCR 反应。反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10.5 μl（购自北京宝日医生物技术有限公司，RR820A）、PCR 正反向引物各0.5 μl、cDNA 0.5 μl、单蒸水8 μl，总反应体系20 μl。反应条件：50℃2 min，95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40 个循环。－20℃保存。以NADPH 为内参对照，取三复孔进行平均，对照组设为100%，对DM-OA组和OA组进行相对定量。H19正向引物：5’-CGTTCCTTTAGTCTCCTGAC-3’，反向引物：5’-AGT-CCGTGTTCCAAGTCC-3’；miR-141正向引物：5’-TCCATCTTCCAGTGCAGTGTR-3’，反向引物：5’-GAACATGTCTGCGTATCT-3’；miR-22 正向引物：5’-AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-3’，反向引物：5’-AGUUCUUCAACUGGCAGCUUUU-3’；NADPH 正向引物：5’-CGGACAGGATTGACAGATTGATAGC-3’，反向引物：5’-TGCCAGAGTCTCGTTCGTTATCG-3’。

1.4 荧光素酶报道基因

设计引物扩增lncRNAs H19 的3’UTR 区序列，将其克隆到PmirGLO 载体，构建PmirGLO-H19-WT质粒；设计相应的H19 突变质粒，构建PmirGLOH19-MUT 质粒。GenePharm 吉玛公司合成miR-22、miR-141 的mimic 及inhibitor 片段，转染相应的质粒及miR-22、miR-141 片段。48 h 后裂解细胞，检测荧光素酶活性。

1.5 qRT-PCR 及蛋白免疫印迹检测β-catenin 与Runx2 表达水平

采用qRT-PCR 及蛋白免疫印迹检测β-catenin与Runx2 表达水平。反应体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ10.5 μl、PCR 反向引物各0.5 μl、cDNA 0.5 μl、单蒸水8 μl，总反应体系20 μl。反应条件：50℃2 min，95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40 个循环。-20℃保存。以内参为对照，取三复孔进行平均，对照组设为100%，对DM-OA 组和OA 组进行相对定量。参照蛋白免疫印迹检测步骤进行操作，依次选取目的条带，分析得出光密度数值，以β-catenin 蛋白与NADPH 密度的比值，计算出各组目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组软骨下骨组织中H19 及miR-141、miR-22表达水平比较

DM-OA 组的H19 表达水平高于OA 组及对照组，miR-141、miR-22 表达水平低于OA 组及对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；OA 组的H19 表达水平高于对照组，miR-141、miR-22 表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图1。

图1 各组软骨下骨组织中H19 及miR-141、miR-22 表达水平比较（n=3）

2.2 荧光素酶报道基因检测H19 靶向吸附miR-141、miR-22 情况

过表达H19 WT 和miR-141、miR-22 片段后，荧光素酶报道的荧光信号明显减弱，差异有统计学意义（P ＜0.01）。miR-141 mimic、miR-22 mimic 相似物对突变质粒的荧光信号不产生影响，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图2。

图2 荧光素酶报道基因检测H19 靶向吸附miR-141、miR-22 情况

2.3 各组软骨下骨组织中β-catenin、Runx2 的mRNA及蛋白表达水平比较

DM-OA 组的β-catenin mRNA、Runx2 mRNA 表达水平高于OA 组及对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；OA 组的β-catenin mRNA、Runx2 mRNA 表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。DMOA 组的β-catenin 蛋白、Runx2 蛋白 表达水平高于OA 组及对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；OA 组的β-catenin 蛋白、Runx2 蛋白表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3。

图3 各组软骨下骨组织中β-catenin、Runx2 的mRNA 及蛋白表达水平比较（n=3）

3 讨论

OA 是中老年人最常见的慢性退化性的关节疾病[13-14]，其中软骨下骨的病变是OA 发生及发展的重要影响因素[15-17]。然而，关于OA 以及糖尿病OA 的发病机制却一直未能被完全揭示[18]。近年来发现，lncRNAs 在诸多生命活动及疾病发展中发挥着重要作用[19-20]。lncRNAs H19 位于人类染色体11p15.5，是最著名印记基因之一[21-23]。研究表明，miR-141 和miR-22 两种miRNA 过表达可以导致人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSCs）中βcatenin 的表达水平显著降低[24]。而H19 可以拮抗这两个miRNA 的功能，最终激活Wnt/β-catenin 信号通路，促进hMSCs 向成骨细胞分化，从而促进骨生成。本研究结果显示，OA 患者的软骨下骨中lncRNAs H19 表达量要高于非OA 患者，通过生物信息学分析发现，H19可以通过海绵作用吸附miR-141 和miR-22，且通过荧光素酶报道基因及突变实验证明了H19 可靶向调控miR-141 和miR-22。同时，糖尿病患者软骨下骨中lncRNAs H19 以及成骨细胞标志物的表达量均要高于非糖尿病患者，这不仅仅解释了糖尿病患者OA的发病率较高、病情发展更加迅速外，同时也进一步提示lncRNAs H19 和β-catenin 之间确实存在一定的关系。

Wnt 信号通路是多细胞真核生物在进化过程中一条非常保守的信号通路。当抑制Wnt/β-catenin 通路后，胞质内β-catenin 浓度增加并进入细胞核内与T 细胞转录因子/淋巴增强因子形成复合体，通过与DNA 结合，进而诱导c-myc、cyclinD 和Runx2 等靶基因的转录，使成骨细胞的细胞周期由G1期进入S 期，而成骨细胞的分化增殖也得到增强[25]。lncRNAs H19导致β-catenin 上调，通过依赖β-catenin 的经典Wnt信号通路促进hMSCs 向成骨细胞分化，导致OA 软骨下骨中骨吸收和骨生成的平衡失调，骨生成增多，导致OA 患者软骨峡谷的硬化，加重OA 的进程。

本研究表明，lncRNAs H19 在OA 患者软骨下骨中的表达水平高于非OA 患者，H19 可直接海绵吸附抑制miR-141 和miR-22，上调β-catenin 蛋白，激活Wnt/β-catenin 通路，从而使OA 软骨下骨中的骨生成增多，软骨下骨硬化。同时本研究创新性发现，糖尿病会进一步上调OA 患者软骨下骨中H19 的表达，这可能是糖尿病患者OA 发病率高的原因，同时也会加速疾病的发展，为研究OA、糖尿病OA 的发病机制以及临床治疗提供了实验基础和新思路。