头穴艾灸联合跑台训练对血管性痴呆大鼠学习记忆和氧化应激的效果

关莹，于国强，唐祎周，辛贵乐，李季，王璐，张立，张春艳

1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨市 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨市 150001

0 引言

血管性痴呆(vascular dementia,VaD)是由多种脑组织缺血缺氧而致的继发性认知障碍综合征，给患者的日常活动和社会生活造成巨大障碍[1]。随着我国人口老龄化加剧，脑血管疾病以及VaD 的患病率呈逐年上升趋势[2]。在众多痴呆类型中，VaD 被认为是可防治的唯一类型[3]。长期口服西药治疗VaD 效果不确定且副作用明显[4]，而中医药优势明显，针灸治疗临床效果显著且不良反应小[5]。本课题组联合应用头穴艾灸与康复训练治疗脑卒中后认知障碍，发现患者的记忆力、计算力、执行能力等认知功能均有显著恢复[6-7]。

慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion,CCH)是VaD 的重要发病机制，氧化应激损伤是VaD发病的病理基础。氧化应激严重损伤海马、皮质等关键脑区的神经元，从而引发学习记忆障碍[8]。本研究以丙二醛(maleic dialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide orgotein dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、谷胱甘肽过氧化物还原酶(glutathione peroxidase reductase,GSH-Px)为主要观察指标，探讨灸康结合对VaD 大鼠海马组织氧化应激反应及学习记忆功能的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物

清洁级6 周龄健康雄性Sprague-Dawley 大鼠40只，体质量180～220 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号SYXK(黑)2010007。饲养环境温度20～25 ℃，相对湿度40%～60%，自由摄食水，鼠笼及垫料定期清洗更换。

1.2 试剂与仪器

SOD 检测试剂盒(WLA110b)、MDA 检测试剂盒(WLA048b)、GSH 检测试剂盒(WLA074b)、GSH-Px检测试剂盒(WLA026b)：沈阳万类生物科技有限公司。Morris 水迷宫：上海欣软信息科技。ZH-PT 型动物实验跑台：徐州利华电子科技发展有限公司。Hettich Mikro 220 冷冻离心机：德国HETTICH 公司。Multiskan FC 型酶标仪：美国THERMO 公司。-80 ℃超低温冰箱：日本PANASONIC 公司。DY89-Ⅱ电动玻璃匀浆机：宁波新芝生物科技股份有限公司。DK-8D型三孔电热恒温水槽：上海一恒科技有限公司。

1.3 造模与分组

大鼠适应性饲养1 周，任意挑选30 只采用双侧颈动脉结扎法(2 vessels occlusion,2VO)[9]复制CCH 致VaD 大鼠模型。术前禁食12 h，禁水4 h，10%水合氯醛3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉；待翻正反射消失后，仰卧位固定，颈部备皮消毒，颈正中切口，长2 cm 左右；钝性分离皮下组织和肌肉组织，充分暴露双侧颈总动脉，丝线分别结扎颈总动脉的远心端和近心端，从中间剪断。观察大鼠呼吸、心跳平稳即缝合皮肤，放回笼中常规饲养。

假手术组8 只，手术步骤同上，分离双侧颈总动脉后仅套丝线，不阻断血流。

大鼠术后均予青霉素4 万U 肌肉注射，每天1 次，连续4 d。密切观察大鼠伤口愈合情况。

造模6 周后，所有造模大鼠采用Morris 水迷宫评估认知功能，筛选出成绩相似的24只分为模型组、针康组和灸康组，每组8只。

1.4 方法

针康组根据《实验针灸学》[10]并参照大鼠骨骼与体型，取百会、神庭穴，采用直径0.25 mm、长25 mm针灸针，针身与大鼠头皮成15°由前向后平刺，深20 mm，得气后快速捻转1 min，将大鼠置于电动跑台内，电击驱动大鼠奔跑[11]，持续20 min。跑台训练后出针。跑台速度：1～3 d 5 m/min，4～14 d 10 m/min，14 d后15 m/min。每天1次，共4周。

灸康组点燃自制细艾条(直径0.5 cm、长10 cm)于大鼠百会、神庭穴处施灸，每次20 min。灸后行跑台训练，方法同针康组。

假手术组和模型组笼中常规喂养。

1.5 Morris水迷宫[12]

Morris 水迷宫为一池壁粗糙的圆形不锈钢水池，直径160 cm，高60 cm，池水深25 cm，水温(21±1) ℃。第三象限中央放置直径10 cm 的无色透明平台，水池注水后水面高于平台2 cm。前4 d 行定位航行试验，每天固定时间段测试2 次：大鼠每天从第三象限以外的任意象限池边圆弧中点入水，从大鼠入水至四肢完全站上平台的时间记为逃避潜伏期；如90 s内未找到平台，引导大鼠站上平台，逃避潜伏期记为90 s。第5 天行空间探索试验：撤除平台，从第三象限以外的任一象限将大鼠放入水中，记录90 s 内大鼠穿越原平台所在区域次数及在目标象限停留的时间。

1.6 氧化应激

水迷宫检测后，大鼠10%水合氯醛3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉，断头取脑，冰盒上迅速分离海马组织，称重后加入预冷的生理盐水，制成10%海马匀浆液，4 ℃3000 r/min 离心15 min，取上清液。按试剂盒说明测量MDA、SOD、GSH和GSH-Px水平。

1.7 统计学分析

采用SPSS 25.0 统计软件进行数据处理。计量资料符合正态分布，以()表示，重复获取结果比较采用重复测量方差分析，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

与假手术组相比，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长，穿越平台次数显著减少，目标象限停留时间显著缩短(P＜0.001)。定位航行实验中，各组大鼠逃避潜伏期呈逐日缩短趋势；训练第3、第4 天，针康组和灸康组逃避潜伏期较模型组显著缩短(P＜0.001)，灸康组短于针康组。空间探索实验中，针康组、灸康组与模型组组间比较，穿越平台次数明显增多，目标象限停留时间显著延长(P＜0.001)且灸康组优于针康组。见表1、表2。

表1 各组逃避潜伏期比较 单位：s

表2 各组空间探索实验结果比较

2.2 氧化应激

与假手术组比较，模型组MDA 水平显著增加，SOD、GSH 和GSH-Px 水平显著下降(P＜0.001)；与模型组比较，灸康组和针康组MDA 水平显著下降，SOD、GSH 和GSH-Px 水平显著增加(P＜0.001)，且灸康组显著优于针康组(P＜0.001)。见表3。

表3 各组氧化应激水平比较

3 讨论

VaD 属中医“呆病”的范畴，其病位在脑，多因脑窍蒙蔽而发病。百会为督脉要穴，位于巅顶，为手足三阳、督脉、足厥阴交会之处；百会配合神庭具有安神定志，调节情绪之功[13]。

CCH后，神经元代谢降低，引起神经元变性，逐渐出现以认知功能受损为主要表现的脑功能减退[14-16]。CCH还可使微血管神经偶联，大血管血流能量供给需求持续增加，最终导致脑功能障碍，出现认知障碍[17]。VaD 的另一病理基础为氧化应激损伤：CCH 使抗氧化能力受损，自由基难以清除，与细胞膜磷脂、核酸、蛋白质等发生反应[18]，导致血管内皮细胞结构和功能受损，神经元破坏，发生VaD[19]。

MDA 是氧自由基攻击生物膜时形成的脂质过氧化代谢终末产物，可反映脂质过氧化程度，间接反映细胞损伤情况[20]。SOD 对超氧阴离子自由基有清除作用，通过阻止脂质过氧化，发挥细胞保护作用[21]。GSH水平与氧化还原状态的稳态密切相关，监测GSH水平有助于疾病早期诊断和评估治疗效果[22]。GSH-Px直接或间接充当抗氧化剂，代表了机体抗氧化能力[23]。

本研究显示，与针康法相比，艾灸与康复结合能更好改善VaD 大鼠的空间学习和记忆功能，更好降低氧化应激水平，发挥脑保护作用。

针刺和艾灸均以经络腧穴为理论基础。针刺以金属针具刺入人体特定穴位，对人体局部产生机械刺激作用，具有调和阴阳、扶正祛邪、行气活血、疏通经络等功效[24]；艾灸通过燃烧艾绒对特定穴区产生温热刺激，发挥温通经络、行气活血、祛湿逐寒、消肿散结、回阳救逆等作用[25-27]。本课题组前期研究证实，头穴针刺可调节大脑皮质的功能，改善病理状态的脑功能[28-30]。但由于认知障碍患者对针刺存在恐惧心理，且部分患者难以接受针刺造成的疼痛、出血等副作用，依从性较差，难以坚持长期治疗。中医传统理论有“针所不为，灸之所宜”“诸疗之要，火艾为良”的记载[31]。艾灸的作用可分为物理和化学两个方面：物理作用即热辐射，包括远红外辐射和近红外辐射，使体内ATP 水解，为细胞活动提供能量[32]，热传递还能改变蛋白质、细胞和组织的性质[33]；化学作用是指艾灸生成物的药理作用，如抗菌、抗病毒、镇痛、抗自由基和抗衰老等[34]。赵利华等[35]的研究显示，艾灸特定穴能降低氧化代谢，提高轻度认知障碍患者认知水平。李丹等[36]发现，艾烟PM10 能拮抗神经细胞氧化应激下的凋亡。

运动疗法是现代康复医学中重要的物理治疗方法，在改善运动功能的同时，也能促进神经系统功能恢复，长期适量运动可增强海马祌经元突触可塑性，提高学习记忆能力[37-38]。跑台运动，尤其是中等强度跑台运动具有抗氧化作用，可抑制氧化应激和神经炎症反应，促进大鼠脑血管神经再生和重要神经递质合成，改善血液循环和神经连接，减轻海马神经细胞损伤，对大鼠空间学习记忆功能产生有益影响[39-41]。规律跑台运动可以激活1 型糖尿病大鼠海马CA1、CA3区信号通路，增强海马抗氧化能力，增强学习记忆能力[42]。跑台训练能上调脑梗死周边皮质Ngb 表达，减轻氧化应激反应，促进神经轴突再生，从而恢复脑梗死大鼠神经功能[43]。

综上所述，本研究通过动物实验证明艾灸与运动疗法的结合可降低氧化应激水平，发挥神经保护作用，从而改善VaD模型大鼠的学习与记忆功能。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。