金莲清热颗粒抑制甲型流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)活性的体外细胞病变实验研究

黎 燕，陈利红，周 红

甲型流感是由新型猪源性甲型H1N1流感病毒引起的人畜共患急性呼吸道传染性疾病，其RNA片段由8条独立的RNA单链组成，具有抗原性漂移和抗原性转变双重特性，易引起病毒抗原变异，出现耐药毒株[1-4]。因此，寻找并开发安全有效的抗流感药物迫在眉睫。金莲清热颗粒由金莲花、大青叶、石膏、知母、地黄、玄参、苦杏仁(炒)七味中药组成，具有清热解毒、利咽生津、止咳祛痰的功效。本文应用细胞病变效应实验了解金莲清热颗粒在细胞水平上对甲型流感病毒A/PR/8/34 (H1N1)株的抗病毒活性，为研究中药抗流感病毒活性和机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料：金莲清热颗粒(批号：200420-1，宁夏启元国药有限公司)，形状为棕色颗粒，贮存条件为常温避光保存。配制方法：受试样品在实验当天使用无菌水溶解到800 mg/mL，经100 ℃水浴加热10 min，冷却至室温后取上清液用于测试。对照化合物：奥司他韦酸(Oseltamivir acid)，来源：MedChemexpress(批号：44039)，贮存条件为-80℃冷冻保存。配制方法：Oseltamivir acid用100% DMSO配制成500 mM 的母液，分装后冻于-80 ℃保存。

1.2 病毒株：流感病毒A/PR/8/34 (H1N1)株购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，货号：VR-1469。

1.3 细胞：犬肾细胞(MDCK)购自ATCC，货号：CCL-34。细胞在添加10%胎牛血清，2 mM谷氨酰胺，1×非必需氨基酸，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的EMEM培养液中维持培养。添加2 mM谷氨酰胺，1×非必需氨基酸，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素及2.5 μg/mL胰酶的OptiPRO SFM培养液用做试验培养液。

1.4 主要试剂：细胞活力检测试剂CCK8由李记生物科技(上海)有限公司生产，货号：AC11L057。细胞冻存液：DMEM培养基、血清和DMSO按照6∶3∶1的比例配置，使用时现用现配[5]。

1.5 主要仪器：细胞记数仪，Beckman；CO2培养箱，Thermo 2401；Multidrop，Thermo；Multidrop Reader，BioTek，Synergy2；酶标仪，Molecular Devices，SpectraMax 340PC384。

1.6 实验方法：应用细胞病变效应(CPE)法探索性研究金莲清热颗粒的体外抗流感病毒活性，Oseltamivir acid作为阳性对照化合物。

1.6.1 细胞铺板： MDCK细胞经胰酶消化后，使用实验培养液将细胞稀释成每毫升含150 000个细胞的悬液。随后将细胞以每孔15 000个细胞接种于96孔细胞培养板中，并于37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。

1.6.2 化合物稀释和病毒接种：次日每孔加入50 μL梯度稀释的受试样品或对照化合物(8个浓度点、三复孔)和50 μL稀释的病毒(MOI=0.006 7)。设置细胞对照(细胞，无化合物处理或病毒感染)、病毒对照(细胞感染病毒，无化合物处理)和培养液对照(只有培养液)。受试样品和对照化合物测试浓度见表1。细胞培养液终体积为每孔200 μL，细胞培养液中DMSO终浓度为0.5%。细胞在5% CO2、37℃培养箱中继续培养5 d，直至无化合物的病毒感染对照孔内细胞病变达80%～95%。

表1 样品测试浓度

1.6.3 细胞活性检测： 病毒感染5 d后吸去上清，每孔加入200 μL试验培养液。使用酶标仪读取每孔本底吸光度值(OD450～OD630)。随后每孔加入200 μL细胞活力检测试剂CCK8，在5% CO2、37℃培养箱中孵育3.5 h后读取每孔吸光度值(OD450～OD630)。CCK8检测后读值减去CCK8检测前本底值用于后续抗病毒活性计算。如含化合物孔的细胞活力较病毒感染对照孔高，即CPE减弱，则表明化合物对所测病毒有抑制作用。

1.7 检测指标：受试样品金莲清热颗粒和对照化合物抗病毒活性及细胞活性，分别由受试样品金莲清热颗粒和对照化合物对病毒引起的细胞病毒效应的抑制率(%)及细胞活率(%)表示。计算公式如下：

抑制率(Inhibition,%)=(测试孔读值-病毒对照平均值)/(细胞对照平均值-病毒对照平均值)×100;

细胞活率(Viability,%)=(测试孔读值-培养液对照平均值)/(细胞对照平均值-培养液对照平均值)×100。

使用GraphPad Prism(Version 5)软件计算受试样品和对照化合物的半数有效浓度(EC50)值。曲线拟合方法为Log(Inhibition) vs.Response-Variable slope。

1.8 统计学方法：采用SPSS 17.0统计软件，多组数据间的对比用one-way ANOVA 进行分析比较，用Linear-Regression对药物剂量与其产生的细胞效应(细胞存活率，病毒抑制率)进行相关性分析。

2 结果

2.1 金莲清热颗粒和对照化合物对流感病毒活性和细胞活性的作用：实验以Oseltamivir acid作为对照化合物，利用流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)的细胞病变效应(CPE)，观察受试样品金莲清热颗粒和对照化合物Oseltamivir acid体外抑制流感病毒A/PR/8/34 (H1N1)株活性。结果显示，细胞对照孔和病毒对照孔读值符合预期。病毒对照孔在培养5 d后细胞活力值相比于正常细胞对照孔读值明显降低。在0.625、1.25、2.5、5 mg/mL浓度范围内，金莲清热颗粒对流感病毒株/PR/8/34 (H1N1)抑制率(Inhibition)平均值分别为50.34%、103.78%、82.3%、64.47%，对以上4个浓度组进行组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；细胞活率(Viability)平均值分别为102.57%、97.26%、88.29%、78.62%，对以上4个浓度组进行组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 金莲清热颗粒和对照化合物对流感病毒活性和细胞活性作用

2.2 受试样品和对照化合物的EC50值:对照化合物Oseltamivir acid对测试病毒株具有明显的抑制活性，EC50值为0.301 μM。受试样品金莲清热颗粒对所测试的流感病毒株A/PR/8/34 (H1N1)具有一定的体外抑制活性，其EC50值为0.564 mg/mL。采用Log(inhibition) vs.response-Variable slope对金莲清热颗粒和对照化合物对流感病毒抑制活性进行曲线拟合，结果见图1(封三)。

3 讨论

由于流感病毒感染普遍存在且无有效的预防措施，抗流感病毒等呼吸道病毒感染药物一直是研究热点。 目前临床上常用于抗流感病毒的药物包括离子通道M2阻滞药(金刚烷胺、金刚乙胺)和神经氨酸酶抑制药(扎那米韦、奥司他韦及帕拉米韦)。离子通道M2阻滞药对甲型H1NI流感病毒无效，神经氨酸酶抑制药也呈现出一定程度的耐药，且由于流感病毒的自身抗原漂移特点，耐药毒株易于出现[6-7]。

我国中草药自然资源丰富，品种繁多，从中寻找高效、低毒、广谱的抗病毒成分，开发出能够应用于临床防治流感的新型药物具有重要意义。中药复方合剂较之单方具有多组分、多途径、多靶点的特点，可有直接抑制病毒或(和)免疫调节作用，发挥抗流感病毒作用，在临床上广泛用于流感的预防与治疗[8-11]。

金莲清热颗粒方中金莲花、大青叶清热解毒；石膏大泻肺胃之热，以防热邪灼伤津液；知母泻肺胃之热以及肾中相火；苦杏仁止咳祛痰，生地黄、玄参清热利咽、养阴生津，故本品具有清热解毒、利咽生津、止咳祛痰的功效。临床主要用于感冒热毒壅盛证，症见高热、口渴、咽干、咽痛、咳嗽、痰稠；流行性感冒、上呼吸道感染见上述证候者[12-14]。金莲清热颗粒在细胞水平上是否对甲型流感病毒H1N1具有良好的抗病毒活性，目前还没有定论。

细胞病变效应(CPE)是指病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。通过检测细胞活力，CPE实验被广泛用于测定药物抑制可引起细胞病变的病毒活性。MDCK 细胞(犬肾细胞株)是一种对不同流感病毒敏感的细胞系，能支持不同型流感病毒复制增殖，是体外评价抗流感病毒的模型系统[15-18]。

为了确定金莲清热颗粒的抗流感病毒效果，我们利用流感病毒敏感的MDCK 细胞株进行体外细胞病变效应实验，探索性研究了金莲清热颗粒在细胞水平上对甲型流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)的抗病毒活性。首先，观察了受试样品金莲清热颗粒对MDCK 细胞活性的影响，发现在0.625、1.25、2.5、5 mg/mL浓度范围内，细胞活率平均值分别为102.57%、97.26%、88.29%、78.62%；在此基础上，以Oseltamivir acid作为对照化合物，利用流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)的CPE，观察受试样品金莲清热颗粒和对照化合物Oseltamivir acid体外抑制流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)活性。结果显示，在0.625、1.25、2.5、5 mg/mL浓度范围内，金莲清热颗粒对流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)抑制率平均值分别为50.34%、103.78%、82.31%、64.47%。以抗病毒活性和细胞活力为指标，计算出受试样品金莲清热颗粒的EC50值为0.564 mg/mL，这些结果初步证明了金莲清热颗粒在细胞水平上对所测试的流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)具有一定的体外抑制活性。

此外，阳性对照化合物Oseltamivir acid 的EC50值为0.301 μM，对测试流感病毒(A/PR/8/34 H1N1株)具有明显的抑制活性。与金莲清热颗粒相比显示，对病毒的抑制作用浓度亦不同，这是由于对照化合物Oseltamivir acid成分单一，结构清楚，而金莲清热颗粒是由多种中草药组成的复方制剂，其中药物辅料占比50%，药物的显效成分和结构不同，故起效浓度不同，但是以它作为参照证明了金莲清热颗粒的抗流感病毒作用。金莲清热颗粒的抗病毒有效成分和结构特征与抗病毒活性的关系仍有待深入研究。