骨髓基质干细胞基于p38MAPK通路对大鼠皮肤创伤修复的干预

皮肤是人体的第一道防线，可抵御病菌的侵袭，保护机体组织器官

。轻度、小范围的皮肤创伤，可自身修复愈合，皮肤创伤修复是皮肤组织离断或缺损后愈合的过程，包括组织再生、瘢痕组织形成等，涉及多种细胞协同作用

。大量研究显示，大面积的皮肤创伤不仅修复时间长，且易感染、易形成瘢痕，给患者带来极大痛苦

。骨髓基质干细胞属于中胚层细胞，取材容易，易分离培养，具有高效自我修复的功能

。有学者研究发现，骨髓基质干细胞可通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）通路活性，抑制炎症因子的表达，促进皮肤创伤修复。本研究设计实验，建立皮肤创伤大鼠模型，分析骨髓基质干细胞对皮肤创伤模型大鼠p38 MAPK通路的影响，旨在探讨骨髓基质干细胞是否通过p38 MAPK通路干预创伤皮肤的修复、镇痛。

学龄前儿童是中耳炎的高发人群［1］，是这一年龄段儿童听力损失的主要原因。声阻抗测试在分泌性中耳炎的诊断上具有很好的灵敏度和特异度［2］。采用声导抗筛查，不需要儿童的配合、检查结果具有客观、准确、快速的特点，是目前理想的群体听力筛查方法。本研究对沈阳地区十家市管幼儿园4 028名学龄前儿童进行了声导抗听力筛查。了解掌握声阻抗异常鼓室图发生率，提出相应的干预措施，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料：选取30只Wistar雄性大鼠[河南中检检测技术有限公司，使用许可证号：SYXK（豫）2018-0006]，年龄4～7个月，平均年龄（5.5±1.2）个月；体重268～295 g，平均体重（281.5±10.8）g。在相对湿度45%～70%、温度（21.2±2.5）℃的环境中适应性喂养1周。本研究严格按照动物实验伦理要求操作，且通过广东省人民医院伦理委员会审批同意。

1.2 试剂：小鼠抗兔IL-6抗体（Sigma公司）、小鼠抗大鼠TNF-α抗体（Invitrogen公司）、兔抗大鼠hs-CRP抗体（Hyclone公司）、兔抗小鼠CD8

抗体（Gibco公司）、大鼠抗小鼠CD4

抗体（武汉博士德生物工程有限公司）、大鼠抗兔p-ERK、p38 MAPK抗体（BD公司）。

1.3 方法

(5) 如果配变状态无电,则根据配变与分支线的关联关系,取回该分支线下的所有配变以及分支线开关的状态;

1.3.2 分组及建模：从选取的30只Wistar雄性大鼠中随机抽取10只作为正常组，剩余20只大鼠建立皮肤创伤模型。实验前给大鼠脱毛，将大鼠固定于手术台，消毒，在脊柱1 cm处，切除2 cm×2 cm的皮肤，简单包扎，建立大鼠皮肤创伤模型，建模过程中大鼠死亡1只，剩余19只大鼠随机分为创伤组9只，骨髓基质干细胞组10只。骨髓基质干细胞组大鼠创伤部位注射骨髓基质干细胞，创伤组、正常组大鼠不做处理，2周后，观察大鼠各项指标的变化。

（e）密码管理：由统一用户身份管理系统统一接管用户在其他应用系统中的账户和密码信息，密码策略按照企业保密规定统一执行。采用统一密码的方式，即企业门户密码与其他应用系统密码保持一致，在企业门户中集成用户的密码管理模块，用户将企业门户密码更改后，接口会把新密码同步到各应用系统中。

1.4.1 大鼠创口愈合率检测：数码相机采集未愈合面积图像，使用Image J软件测量大鼠伤口面积，计算愈合率。愈合率（%）=[（原始创伤面积-未愈合面积）/原始面积]×100%。

［1］周则明,胡友彬,张鹏,等.面向对象程序设计教学实践中的问题探微[J].教育教学论坛,2016(8):209-210.

1.4.2 HE染色和再生上皮厚度检测：断颈处死正常组、创伤组、骨髓基质干细胞组大鼠，取全部创伤部位及周边6 mm全层组织，置于10%福尔马林中固定，石蜡包埋备用。取包埋的皮肤组织，脱蜡，切片，苏木精染色5 min，冲洗，70%、90%酒精脱水10 min，伊红染色2 min，酒精脱水，树胶封片，置于光学显微镜（宁波亿流信息科技有限公司；型号：Auto-MS500）下观察创伤皮肤组织变化。随机选取创伤组及骨髓基质干细胞组大鼠切片各3片，置于光学显微镜下观察，测量再生上皮厚度，取平均值。

1.4.4 酶联免疫吸附法检测IL-6、TNF-α、hs-CRP水平：各组大鼠麻醉后，腹主动脉取血，2 000 r/min离心20 min，离心半径8 cm，分离血清-30℃保存。包被缓冲液稀释待测血清，每孔加0.3 ml待测血清，37℃静置2 h，移去包被液，洗涤液冲洗3次，每孔加生物素化抗体，37℃静置1 h，洗涤，每孔加酶标抗体，37℃静置1 h，每孔加底物液，室温静置0.5 h，每孔加终止剂，使用酶标仪（济南骏驰生物科技有限公司；型号：ST-360），测定IL-6、TNF-α、hs-CRP水平。

1.4.3 大鼠机械痛阈值、热痛阈检测：电子测痛仪（深圳市瑞沃德生命科技有限公司；型号：BIO-EVF4&5）触压大鼠创伤部位，测定机械痛阈值。将大鼠置于玻璃容器中，热板测痛仪（上海益联医学仪器发展有限公司；型号：RCY-2）辐射源瞄准创伤部位，测量大鼠的热痛阈。

在分析压铆件的几何结构和材料特性的过程中使用了下面几个假设[3]：压铆螺母和预置孔在压铆过程中各个位置的变形都是与中心轴对称的，忽略压铆螺母内螺纹，建立二维轴对称参数化模型；压铆螺母和连接板件的材料都满足各向同性，且发生塑性变形时，材料满足各向同性强化准则。

1.4.5 流式细胞仪检测CD8

、CD4

水平：待测血清做抗凝处理，分别加入20μl CD8

、CD4

单克隆抗体，室温孵育30 min，加融血剂，离心，弃上清液，洗涤液充分清洗，加100μl固定剂，加PBS制备为悬液，流式细胞仪（广州吉源生物科技有限公司；型号：CyFlow Cube6）检测CD8

、CD4

水平。

1.4.6 Western blot法检测p-ERK、p38MAPK蛋白相对表达量：使用细胞裂解液裂解样品，测定蛋白浓度，加配置好的SDS-PAGE凝胶，沸水加热3 min，使充分蛋白变性，冷却至室温，电泳，将PVDF膜转模30 min，将蛋白膜置于Western洗涤液中漂洗2 min，加封闭液，4℃封闭60 min，加入一抗，孵育1 h，回收一抗，洗涤，加入二抗，孵育1 h，回收二抗，洗涤，超敏ECL发光液（上海炎熙生物科技有限公司）检测p-ERK、p38MAPK蛋白表达。

2.6 各组大鼠p-ERK、p38MAPK蛋白相对表达量对比：如表5、图2所示，与正常组比较，创伤组、骨髓基质干细胞组大鼠p-ERK、p38MAPK表达较高，差异具有统计学意义（

＜0.05）；与创伤组比较，骨髓基质干细胞组大鼠p-ERK、p38MAPK表达较低，差异具有统计学意义（

＜0.05）。

2 结果

2.1 各组大鼠皮肤创口组织病理学观察：如图1所示，与正常组大鼠（图1A）比较，创伤组大鼠（图1B）皮肤创口组织有严重的炎症浸润现象，新生上皮组织较厚；与创伤组大鼠比较，骨髓基质干细胞组（图1C）大鼠皮肤创口组织炎症浸润明显好转，新生上皮组织接近正常皮肤。

2.2 各组大鼠创口愈合率、再生上皮厚度比较：如表1所示，与正常组比较，创伤组、骨髓基质干细胞组大鼠再生上皮厚度较厚，差异具有统计学意义（

＜0.05）；与创伤组比较，骨髓基质干细胞组大鼠创口愈合率较高，再生上皮厚度较薄，差异具有统计学意义（

＜0.05）。

2.4 各组大鼠炎症因子水平比较：如表3所示，与正常组比较，创伤组、骨髓基质干细胞组大鼠IL-6、TNF-α、hs-CRP水平较高，差异具有统计学意义（

＜0.05）；与创伤组比较，骨髓基质干细胞组大鼠IL-6、TNF-α、hs-CRP水平较低，差异具有统计学意义（

＜0.05）。

2.3 各组大鼠机械痛阈、热痛阈比较：如表2所示，与正常组比较，创伤组、骨髓基质干细胞组大鼠机械痛阈、热痛阈水平较低，差异具有统计学意义（

＜0.05）；与创伤组比较，骨髓基质干细胞组大鼠机械痛阈、热痛阈水平较高，差异具有统计学意义（

＜0.05）。

采用接近于桩基实际工作条件的载荷来确定桩基承载力的方法就是静载实验法。在实验过程中，采用压重平台反力装置对单桩承载力进行检测，通过观测静力载荷测试下的载荷数值，读取传感器上荷载沉降和反弹数据来进行实验数据采集，经过反复实践，并持续增压，达到一定情况后停止荷载的增加，如实记录实验数据。

1.4 指标检测

2.5 各组大鼠免疫因子水平比较：如表4所示，与正常组比较，创伤组、骨髓基质干细胞组大鼠CD8

、CD4

水平较低，差异具有统计学意义（

＜0.05）；与创伤组比较，骨髓基质干细胞组大鼠CD8

、CD4

水平较高，差异具有统计学意义（

＜0.05）。

1.3.1 骨髓基质干细胞分离、培养：取备用大鼠断颈处死，无菌条件下取出股骨、胫骨，DMEM培养基清洗骨髓腔，反复吹打制成悬液，离心，弃上清液，加裂解液，离心，加含10%FBS的培养基悬浮细胞，37℃饱和湿度下培养1周，加0.25%胰酶消化，离心，清洗，加PBS重悬细胞，孵育30 min，离心收集细胞，漂洗，再次重悬细胞至完全离散，室温孵育10 min，加终止液，孵育5 min，加DMEM完全培养基，离心，转移细胞，清洗，制成细胞悬液，以供后续实验使用。

3 讨论

皮肤组织是人体的保护屏障，可隔绝机体与外部环境，若皮肤受创伤后不能及时修复，创伤部位易发生感染

。瘢痕是创伤愈合后的产物，若瘢痕过度，可引起外形及机体功能异常，给患者健康产生极大影响

。近年来，随着我国社会的发展，皮肤创伤发生率呈上升趋势，因此，寻找有效的治疗方法至关重要

。

创口愈合率、再生上皮厚度是判定皮肤创伤修复的指标，皮肤创伤大鼠模型创口愈合率越高、再生上皮厚度越厚，表明其皮肤组织的修复程度越好

。机械痛阈、热痛阈用于评价镇痛效果，大鼠承受机械痛阈、热痛阈时间越长，说明镇痛效果越好

。本研究表明，使用骨髓基质干细胞处理大鼠，能有效提高创口愈合率，减少瘢痕的生成，提高镇痛效果，可能与骨髓基质干细胞可促进皮肤与血管再生有关。

药学专业是技术性非常强的专业，旨在培养学生掌握药学基本理论和专业技能，使其具备从事药品生产、质量检验、药物调剂、合理用药等能力。药学专业校企合作共同培养高素质应用型人才是国家教育发展的需要，也是学生自身职业发展的需要，该培养模式已成为应用型药学人才培养的主导模式[1～3]。校企合作在双赢基础上长效发展，对于学校而言，学生在实习过程中，通过企业生产环境和文化的熏陶，加强了其职业人格和职业素质培养，为今后顺利就业打下坚实基础；对企业来说，可以有效地为企业储蓄一批优秀的技能型人才，以实现企业长足发展。鉴于此，药学专业校企合作应怎样紧密对接，共同培养高素质应用型人才，是我们急需探索和实践的问题。

骨髓基质干细胞又称骨髓间充质干细胞，在特定条件下，可分化为心肌细胞、软骨细胞、上皮细胞等，还可用于软骨损伤、心肌损伤、皮肤创伤等的修复

。有学者研究表示，骨髓基质干细胞可调节皮肤创伤大鼠CPR、IL-10水平，提高创口愈合率，可能是骨髓基质干细胞可促进血管内皮细胞、上皮细胞等处分泌伤口愈合所需因子，从而调控对创伤的修复

。据相关研究显示，骨髓基质干细胞可调控CD4

、CD8

等免疫因子水平，改善机体免疫力，从而保护皮肤组织细胞，促进皮肤功能修复

。本研究表明，使用骨髓基质干细胞处理后的皮肤创伤大鼠，炎症反应得到改善，免疫功能提升。可能与骨髓基质干细胞具有较强的更新与分化潜能，抑制促炎因子分泌，促进组织及损伤的再修复等有关。此外，骨髓基质干细胞还可调控免疫细胞的增殖、分化，从而减轻炎症反应，抑制皮肤组织进一步损伤，促进皮肤创伤的修复。

p38MAPK通路是信号转导中的信号分子，可调节细胞分型及凋亡

。p-ERK可介导Elk-1、Ap-1的转录，参与细胞形态维持、骨架构建等；p38MAPK是一类保守的蛋白激酶，可参与细胞的分化、凋亡

。相关研究显示，皮肤创伤大鼠经骨髓基质干细胞干预后，p38MAPK、p-ERK表达降低。可能是骨髓基质干细胞可抑制p38MAPK通路蛋白活性，促进上皮组织细胞的发育、增殖，从而促进皮肤组织修复

。本研究中，欲进一步探究骨髓基质干细胞对大鼠皮肤创伤的干预效果，拟认为p38MAPK通路与骨髓基质干细胞修复大鼠的皮肤创伤相关。结果显示，经骨髓基质干细胞干预后由p38MAPK介导的信号通路明显被抑制，因此推断，骨髓基质干细胞可通过p38MAPK信号通路抑制p38MAPK、p-ERK通路蛋白活性，抑制IL-6、TNF-α、hs-CRP的合成，阻止皮肤细胞程序性凋亡，减轻皮肤组织损伤，保护皮肤组织。

虽然本研究显示，骨髓基质干细胞可能通过p38MAPK抑制通路蛋白活性，减轻皮肤组织损伤，但目前临床并没有研究证实骨髓基质干细胞、p38MAPK通路与皮肤创伤的联系，且本次研究选取例数较少，有一定的局限性。因此，本研究结果需进一步被证实，以期为临床皮肤创伤的诊治提供新方向。

综上所述，使用骨髓基质干细胞对皮肤创伤大鼠进行干预，可缓解大鼠炎症反应，改善机体免疫力，提高创口愈合率，其作用机制可能与骨髓基质干细胞可抑制p38 MAPK通路活性相关。

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