波尔山羊肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

唐云云，韩 瑞，张文波⋆， 杨 行，陈佳玲

（1.黔西南民族职业技术学院 562400；2.江西农业大学动物科学技术学院 330045）

大肠杆菌是一类广泛存在于自然界，也是人和动物肠道的常在菌群之一。大肠杆菌根据基因组学分析及临床症状可分为3类：共生性大肠杆菌、肠道致病性大肠杆菌和肠外致病性大肠杆菌[1]。共生型大肠杆菌是肠道内的正常菌群，也是肠内有益菌之一；EPEC在健康动物体内检测不到，也不会引起肠外感染,但是动物的饲料和水被其污染后，会引起食用的动物发生严重腹泻和胃肠炎等肠道疾病[2]；ExPEC是一类能引起人和动物肠外组织感染，能引起人或动物的泌尿系统感染、脑膜炎、败血症、心内膜炎和呼吸道感染，给养殖业造成较大经济损失，同时也会危害人类健康，已引起广泛关注。近年来，从鸡[3-5]、猪[6,7]、羊[8]和狗[9]等家畜、家禽中的分离报道越来越多，该菌的致病性、致病机理、耐药性等已成为目前大肠杆菌研究的热点之一。

2017年2月初，南昌某养羊场从外地购进400只波尔山羊，3月初开始发病，出现发热、咳嗽等症状，死亡率约为10%左右，怀疑为羊传染性胸膜肺炎，使用土霉素、氟苯尼考等药物治疗，病情有所好转。4月初，这批羊又开始发病，病羊后躯麻痹、运步失调, 头常弯向一侧，无明显腹泻，后期卧地不起，继而死亡。病死羊尸体极度消瘦、可视黏膜苍白。解剖可见胸部皮下出血，腹腔积液，肠道有出血点，肝脏肿大、有大量针尖大小的出血点，脾脏呈紫黑色，肾脏呈土黄色，肾盂出血，肺脏出血、心脏出血。用多种抗生素治疗无效。根据临床症状、病理变化和治疗情况，初步怀疑为大肠杆菌病。经实验室的细菌分离、生化和分子生物学鉴定，确诊为肠外致病性大肠杆菌感染，并根据药敏试验结果，选用高敏药物进行治疗，控制了病情。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2头病死羊的内脏组织。

1.1.2 实验动物及主要试剂 15±1g 昆明小鼠，购自南昌大学实验动物中心；微量生化鉴定管及药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离纯化 无菌采集病死羔羊的心、肝、脾和肺，分别划线接种于普通营养琼脂平板、麦康凯平板和TSA平板（含5%小牛血清），37℃生化培养箱培养12h，挑单个菌落进行革兰氏染色；并挑单个菌落接种于伊红美兰平板，37℃细菌培养箱培养12h。

1.2.2 生化鉴定 按文献所述方法[10]操作。

1.2.3 菌落PCR鉴定

1.2.3.1 引物设计 根据GenBank中公布的ExPEC的毒力基因iutA的核苷酸序列设计引物，引物为A1：5′－cag tat cag gaa tca ggt agt cca－3′，A2：5′－ctt tac ctc caa cca gat gtt ctt－3′，扩增片段大小为674 bp，引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。

1.2.3.2 菌落PCR 从纯培养平板上挑单个菌落于50µL ddH2O中，99℃ 5min，然后12000r/min离心1 min，取上清作为PCR模板。反应体系：10×PCR MIX 25 µL、上下游引物各1 µL、cDNA模板 5µL，加ddH2O至总体积50µL；94℃5min，94℃ 45sec，54℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，最后72℃ 延伸8min，1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.4 序列测定与比对分析 取PCR产物，送南京金斯瑞生物技术有限公司进行序列测定。所测序列用在线BLAST进行比对。

1.2.5 小鼠致病性试验 挑单个菌落于普通肉汤培养基中，37℃ 220rpm/min振荡培养10h，稀释到浓度为105CFU/mL，小鼠按0.2mL/只进行腹腔注射，同时用普通肉汤注射小鼠作正常对照，观察小鼠的发病及死亡情况，并从死亡小鼠的肝脏和心脏中分离细菌。

1.2.6 药敏试验 从7株分离菌中挑4株分离菌进行药敏试验，操作方法及判定标准均参照文献[11]进行。

1.2.7 临床治疗 使用药敏试验筛选的高度敏感药物进行治疗，并采取消毒等综合防控措施，观察治疗效果。

2 结果

2.1 细菌分离培养

2头羊的内脏器官中共分离到7株细菌（心脏2株、肺脏2株、肝脏2株、脾脏1株）,分别命名为X1、X2，F1、F2，G1、G2，P1。各分离菌在固体培养基上生物特性基本一致。在TSA平板上形成圆形、边缘整齐、灰白色、光滑而不透明的菌落；普通培养基上形成中等大小、湿润、灰白色半透明、边缘整齐的菌落；麦康凯培养基上形成红色、圆形隆起、湿润和边缘整齐的菌落。革兰染色均为阴性，散在或成对排列、两端钝圆的短杆菌。在伊红美兰平板上，可形成紫黑色带金属光泽的菌落。

2.2 生化试验结果

7株分离菌株均能发酵葡萄糖、果糖、甘露醇、麦芽糖和阿拉伯糖，产酸产气；ONPG、尿素、淀粉、鸟氨酸脱羧酶、MR和硝酸盐还原阳性；不发酵赤藓糖、蔗糖、乳糖；赖氨酸脱羧酶、吲哚、H2S和枸橼酸盐为阴性；可液化明胶；符合致病性大肠杆菌的生化特征。结合分离菌的生物学特性，确定分离菌均为大肠杆菌。

表1 分离菌的生化鉴定结果

2.3 菌落PCR及PCR产物序列测定、BLAST结果

通过菌落PCR，从分离菌中均扩增到大小约为670bp的基因片段（图1），与预期大小一致。序列测定结果，7株分离菌的PCR产物核苷酸序列长均为674bp，将所测序列与GenBank中的ExPEC iutA核苷酸序列进行比对分析，结果分离菌的序列与GenBank中登录的ExPEC相应序列的相似性在99～100%之间（图略）。说明7株分离菌均为ExPEC。

图1 分离菌的菌落PCR结果

2.4 致病性试验结果

分离菌均在12h内致小鼠死亡，小鼠的心脏和肠道出血严重、肝上有针尖大小出血点，肺有出血点。从死亡小鼠的心脏、肝脏以及腹水中均可分离到革兰氏阴性的短杆菌。普通肉汤对照组则全部存活。说明分离菌的致病性较强。

表2 动物试验结果

2.5 药物敏感试验结果

4株分离的ExPEC均呈多重耐药，对阿米卡星、壮观霉素和痢菌净较敏感，左氧氟沙星和多粘菌素为中度敏感，对其他10种药物为低敏或耐药（见表3）。

表3 分离菌的药敏试验结果(抑菌圈直径：mm)

2.6 临床治疗

根据药敏试验结果，选用阿米卡星对发病羊进行肌肉注射治疗，盐酸壮观霉素、多维全群拌料，3d后症状明显减轻，连续用药7d，基本恢复正常，治疗后15d和30d回访均正常。

3 讨论

近年来，随着抗生素的滥用，大肠杆菌的耐药性也不断增强，给防控该病带来了非常大的麻烦。羊大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起羔羊及幼龄羊的一种严重腹泻和败血症的急性传染病，具有发病急、死亡快的特点，是危害我国养羊业的重要传染病之一。近年随着养羊业的发展和病原的变异，羊大肠杆菌的防控难题日益突出，分离致病菌，筛选敏感药物，对防控该病有着重要的实际意义。

ExPEC是一种重要的人兽共患病病原，可通过其特有的毒力因子侵袭、定植于肠外组织，并诱发脑膜炎、败血症、肺炎、心内膜炎和手术后感染等。国外学者已从人、牛、鸡、狗、猫体内分离到ExPEC，对该类致病菌的种系发育群、毒力基因型、耐药性、致病性等进行了比较分析，结果显示，ExPEC对人类和动物造成的病理变化差异不大、宿主特异性不强。Moulin- Schouleur M通过血清分型、多位点序列分型技术，对人ExPEC和家禽APEC进行比较，结果显示人ExPEC可能来源于APEC[12]；唐志军等用血清分型和脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术，对227株临床分离的ExPEC进行分析研究，结果肠内致病大肠杆菌血清型能引起临床肠外感染，且主要为ETEC和EPEC血清型，败血症患者的ExPEC可能来源于肠道致病大肠杆菌的移位[13]。因此，分离、鉴定羊ExPEC，分析其来源、致病性和防控新方法，对公共卫生具有重要的意义。

对羊EPEC的研究报道较少。Cortés C等从西班牙某养羊场的病死山羊中分离到肠外致病性大肠杆菌，并对其血清型和毒力因子进行了详细的研究[14]。目前国外的研究主要集中在羊肠外致病性大肠杆菌的血清型及其与人类ExPEC的关系。国内刘正明等对羊源性大肠杆菌药物敏感研究表明，分离株耐7种以上药物的比率达到94.4%[15]；曾博等研究发现，西南地区猪源ExPEC对头孢噻吩和头孢氨苄有很高的耐药水平[16]；郭强强等分离10株ExPEC进行2药敏试验和毒力因子基因检测，结果呈现多重耐药现象，表明多种毒力因子综合作用可能是ExPEC高致病性的主要原因[17]。

本研究从病死羊的内脏器官中分离到7株细菌，经生物学特性、生化鉴定，确定为大肠杆菌；小白鼠致病性试验结果，小鼠在接种后12h内全部死亡，且出现明显的败血症，表明分离菌具有强致病性；通过PCR方法检测到ExPEC特有的毒力基因iutA，表明本次分离菌为肠外致病性大肠杆菌。临床使用经药敏筛选的药物，治疗效果较好。

大肠杆菌作为肠道正常菌群的共生菌，在治疗或预防而使用抗菌药物的选择性压力作用下，其耐药性不断增强、耐药谱也日趋扩大[18]；因饲料等原因使肠道内环境发生改变，促进了耐药基因的传递。共生型大肠杆菌作为一个可能的耐药基因储存库，在耐药基因的传播扩散中发挥了重要作用。国内外的研究表明，ExPEC的耐药性要强于肠内和共生型大肠杆菌[19-21]。本次实验结果也表明，羊ExPEC的耐药性出较强，因羊ExPEC的报道较少，且本次只分离到7株ExPEC，代表性有限。下一步将对羊ExPEC的来源、羊群中的流行现状和分子特性、羊肉食品中的流行及存在现状、耐药谱、毒力和公共卫生学意义等进行研究，以期为我国羊ExPEC的防控提供依据。

4 结论

从病死羊的内脏组织中分离到7株细菌，通过对分离菌的培养特性、生理生化、PCR和序列测定分析、动物试验等，确定分离的细菌为肠外致病性大肠杆菌；药敏试验结果，分离菌对常用的抗生素耐药性较强，仅对3种抗生素中度敏感；使用筛选的药物进行治疗，有效控制了疫情。