粉褶白环蘑的鉴定及急性经口毒性研究*

游金坤，岳万松，孙达锋，崔佳丽，李雪松，吴素蕊**

（1．中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2．云南省食用菌产业发展研究院，云南 昆明 650221；3．云南省药物研究所，云南 昆明 650000）

粉褶白环蘑[Leucoagaricus leucothites（Vittad．）]隶属伞菌目（Agaricales） 蘑菇科（Agaricaceae） 白环蘑属（Leucoagaricus）。目前国内外关于粉褶白环蘑的报道较少，仅有个别形态学特征、毒理学特征[1-3]以及栽培方面的[4-5]研究报道。其中，粉褶白环蘑毒理学特征的相关报道尚存在争议，有研究人员认为其具有胃肠道毒性，不能食用；有学者认为其无毒，能够食用且气味温和鲜美，具有一定经济价值，甚至有科研人员亲自食用以证明其无毒[5-8]。因此，亟需对野生的粉褶白环蘑进行鉴定及毒性评价研究，以期为粉褶白环蘑的快速识别及食用安全性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试样品

野生子实体样品于2021年采集自云南省昆明市晋宁区。采集到的新鲜样品先经拍照、观察，后分为3份。1份冻存于-20℃冰箱，1份于50℃烘箱烘干，1份直接用于DNA的提取。

1.2 品种鉴定

1．2．1 形态学鉴定

形态学鉴定采用传统方法，肉眼观察野生子实体的菌柄、菌盖和菌褶的大小、颜色等宏观形态特征，同时使用游标卡尺测量相关数据。通过参考《中国大型菌物资源图鉴》[9]进行形态学检索、对比，完成初步鉴定。

1．2．2 ITS 序列鉴定

1） 基因组DNA的提取

取子实体样品，采用CTAB提取法[10]进行总DNA的提取。

2） PCR扩增、纯化及测序

使用PCR扩增仪进行PCR扩增反应，引物为上海生工生物工程技术公司合成的通用引物ITS1、ITS4[11]，反应体系为50 μL。经PCR扩增后，进行1．0%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增后的PCR产物使用Takara纯化试剂盒进行纯化[12]，纯化后的PCR样品送至昆明硕擎生物科技有限公司完成测序。

1.3 急性经口毒性试验

1．3．1 试验动物

SPF级ICR小鼠，6周龄～8周龄，体重18 g～35 g，同性别试验动物个体间的体重差不超过平均体重的20%。试验动物生产许可证号：SCXK（浙） 2019-0001，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司。雌雄动物分笼饲养，每笼5只，每日光照12 h，自由采食和饮水。

1．3．2 给药设计

参照参考文献[13]，同时根据粉褶白环蘑毒性、研究现状及试验动物特性进行给药设计。最大给药容积为40 mL·kg-1，按最大给药容积、最大给药浓度给药；以给药当天动物禁食后的体重计算给药量。

1．3．3 粉褶白环蘑样品准备

鲜样品处理：取冻存于-20℃的鲜品，解冻后剪碎、研磨，加少量超纯水球磨匀浆，得到均一的匀浆液。稀释匀浆至设定的样品质量浓度，即0．37 g·mL-1和 0．74 g·mL-1，其中 0．74 g·mL-1为小鼠可给予的最大给药浓度。

干样品处理：烘干的样品粉碎，过100目筛，获得粉褶白环蘑粉末。称取粉末以超纯水混匀，使样品质量浓度分别为 0．083 g·mL-1和 0．170 g·mL-1，其中0．170 g·mL-1为小鼠可给予的最大给药浓度。经检测其鲜品的水分含量为88．83%，则干样品对应的鲜品品的质量浓度分别为 0．74 g·mL-1和 1．52 g·mL-1。

1．3．4 给药试验及给药后观察

将50只ICR小鼠随机分为5个组，每组雌雄各半。组别设置为干品1组（9．96 g·kg-1）、干品2组（20．40 g·kg-1）、鲜品1组（44．40 g·kg-1）、鲜品2组（88．80 g·kg-1）及溶剂对照组。动物禁食不禁水约6小时后，每间隔4小时分别给予各剂量组粉褶白环蘑样品，共给药3次；于第2次给药2小时后给予少量饲料；末次给药后喂饲常规饲料，自由饮水。

给药前、给药当天及给药后连续14 d观察各组动物的一般症状及体征。观察动物是否出现与受试物相关的异常症状和体征，观察至动物恢复或死亡。分别于给药后1 d、2 d、4 d、7 d、14 d时称量动物体重；14 d观察结束后动物牺牲，进行大体解剖观察病理学变化。临床观察指标包括皮肤、被毛、眼、粘膜以及呼吸系统、泌尿生殖系统、消化系统和神经系统等。观察并记录动物毒性症状产生的时间、程度、持续时间。

1.4 数据处理

1．4．1 鉴定数据处理

将测得的ITS序列（编号BHM） 用DNAMAN进行拼接，ITS序列提交GenBank数据库进行BLAST比对。用MEGA 5．1将获得的多条参考序列进行多重对位排列，并手动去除排列结果中两端的非对位排列区，对碱基组成、保守位点、信息位点等序列特征进行分析。用MEGA 5．1中的K-2-P（Kimura-2-parameter）模型计算遗传距离，构建距离矩阵。以香菇（Lentinula edodes） 为外群，用邻接法NJ（neighbor joining）构建系统发育树。

1．4．2 急性经口毒性试验数据处理

数据均采用SPSS 22．0分析，均以平均值±标准差表示，多样本间平均值差异采用t检验，以P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 形态鉴定结果

野生新鲜大型真菌样品子实体形态特征见图1。

图1 野生大型真菌样品子实体形态Fig．1 Morphology of fruit body of wild macrofungi sample

如图1所示，野生子实体样品的菌盖直径为5 cm～11 cm，呈白色至奶油色，表面光滑，有时出现龟裂，中央有时浅灰色至灰色；菌肉呈白色；菌褶离生，幼时白色，成熟后米色或略带粉色；菌柄长度为 5 cm～15 cm，直径为 0．5 cm～2．0 cm，圆柱形，幼时白色，成熟后中下部多呈灰褐色。根据形态学鉴定结果，初步将其鉴定为白环蘑属真菌（Leucoagaricus sp．）。

如图1所示，拍摄时子实体不具菌环，但根据参考文献[9]，白环蘑属真菌应具菌环，菌环中位，白色至奶油色，且不易脱落。因此，需要采用分子手段进一步进行菌株鉴定。

2.2 系统发育分析

通过rDNA-ITS鉴定方法，以样品的ITS序列及与其高度相似的序列构建系统发育树，NJ聚类分析结果见图2。

图2 基于ITS序列构建的系统发育树Fig．2 Phylogenetic tree based on ITS sequence

如图2所示，测序比对结果表明野生子实体样品序列BHM与GenBank中编号为OL653103、MT535726．1和MN202793的3个粉褶白环蘑菌株的ITS序列相似性高达100%；结合子实体形态学特征和ITS序列分析结果，将该野生子实体鉴定为粉褶白环蘑 [Leucoagaricus leucothites（vttad）．]。

2.3 急性经口毒性试验结果

粉褶白环蘑口服急毒性试验期间所有动物均存活，且大体解剖未发现任何临床异常症状。在试验期间，4个粉褶白环蘑给药组体重及体重增长百分率与对照组间无显著性差异。

鲜品2组ICR小鼠经口给予粉褶白环蘑鲜品极限急性毒性剂量88．80 g·kg-1后，3/5只雌性小鼠出现活动减少、俯卧、弓背的动作行为影响症状；其中1只雌性小鼠还出现眯眼、蜷缩成团的动作行为影响症状；以上症状均在给药后2分钟出现，持续13 min～33 min 后恢复正常。而干品剂量 9．96 g·kg-1（相当于鲜品剂量88．80 g·kg-1）及干品极限急性毒性剂量20．40 g·kg-1（相当于鲜品剂量183．00 g·kg-1）试验组中，均未观察到与受试物相关的异常。

试验中粉褶白环蘑鲜品、干品的小鼠最大可耐受给药剂量换算至人分别为683 g/人、157 g/人（相当于鲜品1 411 g/人）。以上结果表明，粉褶白环蘑的半数致死量LD50（lethal dose 50%） 远大于实际无毒级别剂量（500 g/人）。

3 讨论

粉褶白环蘑经口急性毒性试验结果表明，粉褶白环蘑的鲜品、干品均为实际无毒级别食品。研究结果提示，急性极限服用粉褶白环蘑鲜品情况下，雌性小鼠可能出现活动神经系统及神经肌肉系统中动作行为受抑制的症状；但该症状在更高剂量（相当于摄入鲜品极限急性毒性剂量的2倍）的干品组中并未出现。由此表明粉褶白环蘑干品食用安全性高于鲜品，在其干品制备过程中可减弱或消除鲜品中可能含有的毒性成分的影响；且可能毒性成分对小鼠的影响具有性别差异。相关可能作用机制将在后续对粉褶白环蘑的开发中进行研究。

环柄菇类真菌分类复杂，种类繁多且外形特征相似，部分环柄菇如酒红环柄菇（Lepiota josserandii Bon&Boiffard）、褐鳞环柄菇 （Lepiota helveola Bres．）等为剧毒品种[14-15]。而环柄菇类真菌多分布于草坪、路边、森林边缘等极易被采食的位置，误食有毒环柄菇导致中毒的风险概率极高。通过此次研究，证明了粉褶白环蘑为实际无毒级别食品，为其快速识别及食用安全性提供了理论基础。已有研究表明，粉褶白环蘑气味温和，味道鲜美，子实体货架寿命比一般肉质食用菌长2倍～3倍，且常温下保存不易变软或腐烂[5]，是值得进一步开发的新型野生食用菌。因此，对粉褶白环蘑进行鉴定及安全性评估的研究不仅具有科学和生态学意义，而且具有产业潜力，可为其开发利用及大规模的商业化栽培提供了科学依据。