诺丽发酵汁介导肠道菌群缓解小鼠DSS结肠炎

曲泰齐，张家超，汪瑞敏，刘四新，任发政，李从发*

（1 海南大学食品科学与工程学院 海口 570228 2 中国农业大学营养与健康系 北京 100193）

炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD） 是慢性免疫介导性疾病，包括克罗恩病(Crohn's disease，CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC），会引起从直肠到近端结肠不同程度的浅表黏膜炎症[1]。溃疡性结肠炎患病率逐年增加，已成为新的全球公共卫生问题[2]。溃疡性结肠炎典型的组织学改变包括隐窝密度降低，隐窝结构被破坏，黏膜表面不规则以及黏膜炎症。

大量研究证实，环境因素、饮食、药物、机体免疫和肠道菌群变化与溃疡性结肠炎的发生、发展密切相关。肠道菌群紊乱引起的免疫反应失调是造成溃疡性结肠炎的主要病因之一[3]。肠道菌群可通过影响机体消化、代谢和营养素的吸收来维持肠道上皮完整性以及防止有害微生物的入侵和生长来影响人体免疫状态[4]。肠道作为人体最大的开放系统之一，表面布满大量细菌、真菌和病毒[5]。一方面，肠道需要抵抗外来有害病原体入侵，另一方面需要耐受肠道中寄生的微生物[6]。当肠屏障功能受损和肠道菌群失调时，肠道菌群与宿主之间的复杂相互作用可能被破坏，导致溃疡性结肠炎的发生[7]。溃疡性结肠炎的发生与肠道菌群的变化密切相关。

饮食在肠道菌群群落结构中起着重要作用[8]。科学饮食可以有效协助治疗IBD，并被认为是目前可用的除医学和外科疗法之外的治疗手段[9]。诺丽（Morinda citrifolia Linn，noni），又称海巴戟天或海巴戟，主要分布在南太平洋诸岛屿、澳大利亚、东南亚，以及我国海南岛、西沙群岛和台湾等地[10]。波利尼西亚人将它用作食品、药品已有约2 000年历史[11]。诺丽富含抗炎相关的生物活性物质，如诺丽多糖、表儿茶素和东莨菪亭等[12]。诺丽果浆是新食品原料，诺丽发酵果汁（Fermented noni juice，FNJ） 是将整果在容器中密闭2～6 个月而成，是诺丽加工的主要产品。研究表明，诺丽果提取物可改善肠道菌群并在体外发挥抗炎作用[13]；诺丽果汁可降低炎症细胞因子的表达[14]；诺丽发酵汁具有调节免疫平衡和皮肤屏障功能[15]。

在UC 的发病过程中，肠道炎症与肠道菌群失调之间的因果关系尚不清楚。从肠道菌群的角度看，FNJ 对UC 的影响未得到充分研究。本文从肠道菌群介导的角度研究FNJ 对UC 的免疫调节作用。通过分析组织病理学、血清中细胞因子水平和肠道菌群组成，阐明肠道菌群介导UC 的潜在机理以及FNJ 的药用价值和保健作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性C57BL/6 小鼠，6 周龄，体质量18～20 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。动物实验室恒温（22 ± 2）℃，恒湿【（55 ±5）%】，每12 h 昼夜交替。所有小鼠自由饮水采食。

1.1.2 试验原料 FNJ，海南方广新农业开发有限公司。

1.1.3 试剂 葡聚糖硫酸钠 （Dextran sulfate sodium，DSS），上海翊圣生物科技有限公司；肿瘤坏死因子（TNF-α）检测试剂盒、小鼠白细胞介素6（IL-6）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒，上海信裕生物科技有限公司；4 %多聚甲醛通用型组织固定液，索莱宝生物科技有限公司。

1.1.4 仪器与设备 Multiskan FC 酶标仪，赛默飞世尔科技有限公司；BX51T-PHD-J11 显微镜、CMOS，日本Olympus 公司；Image-Pro Plus 多功能真彩色细胞图像分析管理系统，美国Media Cybernetics 公司；RM2015 切片机，德国莱卡；Neofuge 15R 高速冷冻离心机，力康发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物实验 适应性喂养7 d 后，将30 只小鼠随机分为3 组，分别为空白组（C）、模型组（M）和FNJ 饲养组（N），每组10 只。M 组和N 组连续7 d 灌胃3%葡聚糖硫酸钠溶液10 mL/（kg·d），C组灌胃生理盐水。N 组小鼠连续14 d 灌胃0.2 mL/20 g FNJ，C 组和M 组灌胃生理盐水。第15 天收集小鼠的粪便样品，-80 ℃条件下保存。眼球摘除取血，4 ℃、3 000 r/m 离心10 min，分离血清。采血结束后，颈椎脱臼处死小鼠，解剖取结肠组织并测量长度后于-80 ℃保存。

1.2.2 结肠病理组织学分析 将结肠横切并用4%多聚甲醛固定后石蜡包埋，4 μm 切片。使用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗。使用苏木素和伊红染色。经脱水、透明、封片后对结肠组织进行组织病理学分析，评估溃疡、炎症浸润和隐窝结构异常。

表1 DSS 诱导结肠炎的疾病活动指数评分系统Table 1 Disease activity index scoring system of dextran sodium sulfate-induced colitis

1.2.3 血清细胞促炎因子测定 使用ELISA 试剂盒检测血清细胞促炎因子TNF-α 和IL-6。用Multiskan FC 酶标仪测定样品在波长450 nm 处的吸光度值。以标准物的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。根据样品的吸光度值由标准曲线计算出相应的质量浓度，比较不同组间两种血清细胞促炎因子质量浓度差异。

1.2.4 16 S rDNA 测序 测序工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。采用CTAB 冻融法提取每组粪便样品的总DNA，采用Nanodrop 对DNA 进行定量，并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳试验检测DNA 质量。然后，通过PCR 扩增目标片段。采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep 试剂盒制备测序文库后上机，进行高通量测序。所得测序数据根据序列质量初筛，重测、补测问题样本。通过筛选的原始序列，按照index和barcode 信息进行文库和样本划分，同时去除barcode 序列。按照QIIME2 dada2 分析流程去噪、OTU 聚类。在OTU 层面进行Alpha 多样性和不同组间的Beta 多样性差异及差异显著性分析。利用LEfSe 在物种分类学组成层面衡量不同组间物种丰度组成差异，寻找标志物种。

1.2.5 统计分析 试验数据以平均值±标准误（x±s）表示。用SPSS 22.0 的单因素方差分析和Duncans 多重检验比较均值。显著性水平α=0.05。使用Origin 2019b 和R 绘制图表。

2 结果

2.1 FNJ 干预对大鼠体质量的影响

从体质量和疾病活动指数两个方面评估FNJ对DSS 诱导的UC 的缓解效果。通过灌胃DSS 诱导小鼠溃疡性结肠炎，并每周进行疾病活动指数（Disease activity index，DAI）评分。在实验开始前，3 组小鼠的体质量之间没有显著性差异。DSS灌胃1 周后，C 组的体质量从（22.44±0.35）g 增到（23.74±0.26）g，而其它两组的体质量有下降趋势（P<0.001）。干预1 周后，N 组小鼠在一定程度上恢复了体重（图1b 和1c）。此外，灌胃DSS 1 周后，小鼠出现明显的腹泻和轻微出血，这在DAI 中得到反映（图1a）。两周后，N 组的DAI 与C 组没有显着差异，而M 组的DAI 高于其它两组 （图1a）。

图1 各组小鼠的疾病活动指数得分（a）、体质量变化（b 和c）Fig.1 The DAI index （a) and weight changes （b and c） of mice

2.2 FNJ 对小鼠组织病理学的影响

DSS 诱发的结肠炎与结肠长度的显著减少有关，它通常被用作DSS 结肠炎炎症程度的形态学参数[8]。M 组的结肠长度显著小于C 组和N 组，并且C 组和N 组之间没有显著性差异，这说明FNJ的干预缓解了结肠的损伤（图2a）。

通过组织病理学进一步观察结肠损伤程度（图2b）。C 组肠黏膜和隐窝结构完整，无溃疡和破损。与C 组相比，M 组被观察到结肠组织病变，肠黏膜破损以及肠上皮细胞的死亡和脱落，肌肉层出现炎性水肿和少量炎性细胞浸润。同时，FNJ 的干预使得N 组的病变减轻。N 组的隐窝深度介于C 组和M 组之间，M 组的隐窝深度最小。M 组的肠壁厚度明显更薄，与其它两组相比依次为：C>N>M。

图2 小鼠结肠长度比较（a）、小鼠结肠100x 代表性HE 染色组织学观察（b）Fig.2 Colon length comparison （a) and representative histological observation （b) of HE mice colon at original magnification of 100x

2.3 FNJ 对小鼠血清炎症因子的影响

血清中的TNF-α 和IL-6 是两种典型促炎细胞因子。结果如图3a 所示，M 组的TNF-α 水平【（55.20±2.21）pg/mL】显著高于C 组【（28.53±4.78）pg/mL】和N 组【（37.47±8.52）pg/mL，P<0.001】。同时，M 组的IL-6 水平【（15.26±1.35）pg/mL】与C 组【（11.02±0.72）pg/mL，P<0.001】和N 组【（10.17±0.43）pg/mL，P<0.001】有显着差异（图3b）。综上所述，FNJ 干预显著降低了结肠炎小鼠血清中TNFα 和IL-6 的含量。

图3 FNJ 对小鼠血清生化因子的影响Fig.3 Effects of FNJ on the serum biochemical factorinmice

2.4 FNJ 对小鼠肠道菌群α、β 多样性的影响

使用QIIME 分析平台比较肠道菌群的α 多样性。Chao1 指数用于表征样品中物种的丰度，而Shannon 指数用于表征微生物多样性。各组的Chao1 指数和Shannon 指数没有显著差异（图4a～b）。β 多样性分析是对不同样品、不同组间样品的微生物群落构成进行比较分析。通过主坐标分析图观察到明显的聚类现象。图中的圆圈表示50%的置信区间（图4c）。PCoA 图显示，M 组和C 组之间的微生物结构具有显著性差异。此外，N 组的微生物组成与M 组相比也有显著差异，与对照组更为相似。图4d 表示每组样本与C 组之间的距离，距离越大菌群差异越大。N 组和C 组之间的距离较M 组更短，这表明N 组与C 组肠道菌群的物种组成更为相似。

图4 FNJ 对小鼠肠道微生物群α 和β 多样性的影响Fig.4 Effects of FNJ on the α and β diversity of gut microbiota in mice

2.5 FNJ 对小鼠肠道微生物组成的影响

进一步分析每组在门和属水平上的肠道菌群。对相对丰度大于1%以上的物种进行分析，所有相对丰度小于1%的菌群合并为其它。经筛选和优化后，共检测到10 个门，20 个纲，30 个目，51个科和61 个属（图5a～b）。在门水平上，与C 组相比，M 组中厚壁菌门的相对丰度显著增加 （P<0.05），而拟杆菌门的相对丰度降低（图5a）。与对照组相比，FNJ 的干预使得N 组恢复了厚壁菌门（P<0.05）和拟杆菌门相对丰度水平。在属水平上（图5b），与C 组相比，M 组DSS 处理上调了双歧杆菌属和乳杆菌属的相对丰度（P<0.01）。同时N组瘤胃球菌属相对丰度显著低于模型组（P<0.05）。采用线性判别效应量分析方法（LEfSe）鉴定生物标志物，找出每组的优势微生物 （图5c～d）。C 组、M 组和N 组在不同水平上分别有3，5 和11 个显著不同的分类单元 （LDA 得分>2）。M 组中，LDA 得分最高的为厚壁菌门，其次为乳杆菌属。N 组中柄杆菌目、嗜酸菌属是优势类群。C 组是厌氧棒状菌属、红球菌属和诺卡氏菌科为优势类群。M 组和N 组的分类单元相互独立。

图5 FNJ 对小鼠肠道微生物组成的影响Fig.5 Effects of FNJ on the composition of gut microbiota in mice

2.6 血清炎症因子与肠道菌群相关性分析

菌群与血清炎症因子的关联分析结果如图6所示。S24-7、普雷沃氏菌和拟杆菌与IL-6 和TNF-α 呈负相关，而梭菌、瘤胃球菌、螺杆菌和双歧杆菌与IL-6 和TNF-α 正相关。此外，阿洛巴氏菌属与TNF-α 正相关，乳杆菌属和IL-6 呈正相关（图6）。

图6 血清细胞因子与微生物群的相关性分析Fig.6 Correlation analysis between serum cytokines and microbiota

3 讨论

利用DSS 诱导的UC 模型探讨FNJ 对UC 的药用价值。研究结果表明，饲喂FNJ 可以显著缓解小鼠UC 的临床表观病理性状，抑制血清中的促炎细胞因子分泌，还可有效减轻由UC 引起的肠道菌群紊乱现象。

促炎因子TNF-α 和IL-6 在肠道炎症的发展中起着至关重要的作用[16]，其增加与UC 的严重程度有关[17]。本研究中，FNJ 处理降低了血清促炎细胞因子TNF-α 和IL-6 的产生，这可能是由于FNJ中的抗坏血酸和类黄酮苷对NF-κB 信号通路起到抑制作用[18]。研究表明，TNF-α 主要由巨噬细胞响应各种病理过程而产生，并具有与结肠炎有关的多种生物学活性。TNF-α 刺激免疫细胞产生和释放其它细胞因子、趋化因子、炎性脂质前列腺素E2以及活性氧和氮[19]，而FNJ 处理后TNF-α 的减少可能抑制上述下游反应。IL-6 可以通过调节T细胞分化，控制促炎T 细胞亚群 （例如Th1 或Th17 细胞） 与免疫抑制性调节T 细胞之间的平衡[20]。M 组中升高的IL-6 打破了这一平衡，N 组的FNJ 处理则将IL-6 下调至与正常组相近的水平，恢复了两种细胞亚群间的平衡关系。

目前，越来越多的证据表明，肠道菌群在IBD的发展和治疗中起着重要的作用[21]。通常，肠道菌群与宿主共生并处于动态平衡状态[22]。肠道菌群本身或其代谢产物（如脂多糖等）可以用作抗原性物质，通过刺激肠道上皮细胞或免疫细胞来促进宿主免疫功能的改善[23]。当肠道菌群失衡时，肠黏膜屏障将被破坏，导致大量病原微生物的入侵并在肠道内引发强烈的免疫反应，这将进一步加剧肠道菌群紊乱，并最终导致或加剧UC 的发生[24-25]。维持肠道菌群的稳态在UC 中起着不可忽略的作用。本研究中，通过16S rDNA 基因测序研究了FNJ 对DSS 诱导的UC 小鼠肠道菌群的影响。研究结果表明，FNJ 的摄入可以调节肠道菌群群落结构至接近对照组水平。根据PCoA 图，DSS 诱导的UC 小鼠的细菌群落与治疗组明显不同，这表明FNJ 可以调节与UC 相关的肠道菌群的紊乱。在DSS 诱导的模型组中拟杆菌属的相对丰度降低，双歧杆菌属和乳杆菌属的相对丰度增加，与先前的研究结果一致[26]。双歧杆菌和乳酸菌作为常见的益生菌被学者们关注[27]。Leccese 等[28]发现双歧杆菌可以通过影响IL-23/Th17 轴来调节UC。通常，摄入足够量的益生菌对宿主的健康有益。然而，Mileti 等[29]发现副干酪乳杆菌可以延迟UC 的发展并降低疾病的严重性，植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌GG 却促进了DSS 诱导的结肠炎的发展。Tsilingiri 等[30]发现在培养结束时，植物乳杆菌可诱导体外培养的健康组织炎症反应的发生，这与沙门氏菌的诱导反应相似。双歧杆菌和乳杆菌在结肠炎中虽起重要的作用，但其益生和致病作用仍需进一步证实。

本研究中，FNJ 明显减轻了小鼠DSS 引起的UC 病理学临床指标，并调节小鼠的肠道菌群紊乱。FNJ 在预防DAI 升高和治疗结肠组织损伤方面有显著功效。此外，FNJ 通过调节免疫系统相关的血清促炎细胞因子水平，发挥相关抗炎作用。研究结果为维持肠道稳态和UC 的治疗方法提供新的思路。今后需进一步确定FNJ 的特定活性成分在调节肠道菌群和炎症相关信号通路中的作用，探讨其药用价值。