超高压处理对牡蛎中GII.4型诺如病毒的消减控制

佟利惠，杨 敏，赵 峰，苏来金，王珊珊，周德庆

（1 上海海洋大学食品学院 上海 201306 2 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋药物与生物制品功能实验室 山东青岛 266071 3 重庆三峡学院生物与食品工程学院 重庆 404100 4 温州大学生命与环境科学学院 浙江省水环境与海洋生物资源保护重点实验室 浙江温州 325035 5 温州市特色食品资源工程技术研究中心 浙江温州 325006）

诺如病毒（Noroviruses，NoVs）是世界范围内引起非细菌性急性胃肠炎的主要病原体[1]，可分为7 个基因簇（GI～GVII），其中GI、GII 和GIV 可感染人类，GI、GII 又可进一步分为9 个和22 个基因型[1-3]。NoVs 具有极强的传染性，被感染者表现为腹泻或呕吐，常通过被污染的环境、水源及水产品如贝类等引起急性胃肠炎疫情暴发[4-6]。冬、春季节是诺如病毒疫情的高发期，近几年我国及美国、日本、西欧等许多国家都出现过大规模诺如病毒暴发的报道[7-10]。素有“海洋牛奶”之称的牡蛎是沿海地区重要的经济贝类，也是NoVs 的传播媒介之一。牡蛎的栖息地主要在沿海河口，营固着生活，更容易受到污水等环境污染[11]。牡蛎属于滤食性双壳贝类，可在过滤海水时富集环境中的NoVs，体内病毒浓度可比周围环境中的高几十到几千倍[3，12-13]。彻底的加热处理虽可有效灭活牡蛎中存在的NoVs，但会破坏牡蛎的鲜美风味，人们倾向于生食或轻微烹煮。若牡蛎中存在NoVs 污染，就会增加感染NoVs 的风险。

目前，食品中NoVs 的检测主要采用反转录实时荧光定量聚合酶链式反应 （Reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR），此方法针对NoVs 的核酸进行检测，部分NoVs 失活后，核酸仍然存在，然而，该方法不能很好地区分NoVs 的存活状态，也就无法区分NoVs 是否具有感染性。研究发现传统的光激活染料 【叠氮溴化丙锭 （Propidium monoazide，PMA）和叠氮溴化乙锭（Ethidium monoazide，EMA）】、改进的光激活染料 （PMA 增强版——PMAxx，同时包含PMA 和EMA 的双光激活染料PEMAX）及猪胃黏蛋白磁珠（Porcine gastric mucin magnetic beads，PGM-MB） 常用于消减处理后感染性NoVs 存活率的检测[14-18]。现报道较多的为PMAxx 和PGM-MB。Ye 等[19]用PGM-MB 对经500 MPa/0 ℃HHP 处理的牡蛎中的GⅡ.4 型NoVs 进行检测，NoVs RNA 拷贝数可减少4 lg（copies/μL）。PGM 包含多种组织血型抗原，可与不同基因型别的NoVs 特异性结合，然而其在商业化生产中存在较大的变异性，造成重复性较差。PMAxx 是一种高亲和力的光反应性核酸染料，虽不能进入衣壳蛋白完整的NoVs，但能够穿透被破坏或损坏的衣壳，在强光照射下共价插入RNA，干扰RT-PCR 扩增[17]。在RT-qPCR 检测前，利用PMAxx 对样品进行预处理，可用来区分感染性NoVs。

非热加工技术可在保证食品安全（杀灭有害病原体） 的条件下实现最小程度地影响食品原有营养、风味和质构等，在水产品加工中应用较多的有超高压 （High hydrostatic pressure，HHP）、臭氧、辐照及紫外照射处理等[20-22]。超高压技术可用于牡蛎等双壳贝类的脱壳，使壳与肉分离，保持营养成分基本不变，还能有效杀灭有害病原体，延长贮藏期[23]。Takahashi 等[24]对缓冲液、牡蛎匀浆、带壳牡蛎3 种基质中的鼠诺如病毒（Murine norovirus strain 1，MNV-1）进行HHP 处理，结果表明：HHP 对这3 种基质中的NoVs 都有消减效果，在缓冲液、牡蛎匀浆、带壳牡蛎中的消减效果依次降低，表明HHP 对MNV-1 的消减灭活效果与基质有关，这可能是由于牡蛎中的蛋白质、脂肪等成分可以保护MNV-1 不受HHP 影响。因人源诺如病毒难以进行体外培养，故现有的HHP 研究多采用MNV 进行，且在研究HHP 对NoVs 的消减作用时，仅使用病毒稀释液，未考虑食品基质对病毒消减的影响。同时，受RT-qPCR 的限制，无法区分NoVs 的感染性。

本文以PMAxx 检测同RT-qPCR 相结合，评价该方法区分感染性NoVs 的效果；对牡蛎消化腺匀浆和缓冲液中GⅡ.4 型NoVs 在不同压力下进行HHP 处理的效果，评估食品基质对NoVs 耐受HHP 处理的影响，探究HHP 处理对GⅡ.4 型NoVs 的消减控制效果以及对牡蛎脂肪氧化和蛋白质变性的影响，以期为HHP 技术在牡蛎加工中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

太平洋牡蛎（Crassostrea gigas），山东威海乳山市牡蛎养殖区；GⅡ.4 NoVs 样品（经测定GⅡ.4 NoVs RNA 拷贝数为5.0×108copies/μL），分离自腹泻患者。

1.2 主要试剂

氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、25%戊二醛溶液、Triton X-100，国药集团化学试剂有限公司；Trizol、病毒RNA 提取试剂盒，Evo M-MLV 一步法RT-qPCR 试剂盒，艾科瑞生物；PMAxx，美国Biotium 公司；丙二醛含量测定试剂盒、巯基含量测定试剂盒，北京索莱宝公司；RT-qPCR 所用引物如下：QNIF2 （FW）：ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA，COG2R （ REV ） ：TCGACGC CATCTTCATTCACA，QNIFs （PROBE）：FAMAGCACGTGGGAGGGCGAT CG-TAMRA，由睿博兴科生物技术有限公司合成；质粒标准品，博尚生物技术有限公司。

1.3 设备与仪器

BY-600-1 全自动高压杀菌机，温州滨一机械有限公司；JEM-1200EX 透射电子显微镜，日本电子株式会社；BYQ6094-550148 荧光定量PCR 仪，杭州博日科技有限公司；酶标仪，Thermo 公司；H1650-W 高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；GR60DA 压力蒸汽灭菌器，ZEALWAY公司；HH-4A 数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；32990927 电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；F013300046 手持均质机，DREMEL公司。

1.4 试验方法

1.4.1 PMAxx-RT-qPCR 检测方法评价

1.4.1.1 热处理 为了评价PMAxx-RT-qPCR 检测方法区分NoVs 感染性的效果，取2 mL 1 000×稀释的GⅡ.4 型NoVs 样品，分别在沸水浴中加热5，10，15，30 min 和湿热灭菌（121 ℃，20 min）条件下处理，随后均用PMAxx 处理。

1.4.1.2 PMAxx 处理 取400 μL 样品于1.5 mL离心管中，设置平行组，对照组不做PMAxx 处理。避光操作，加入0.1 mmol/L PMAxx，使其在样品中的终浓度为25 μmol/L，加入0.5% Triton X-100，在黑暗中室温孵育10 min，在摇床上进行孵化，试管上覆盖铝箔[14]。立即将样品暴露在60 W 蓝光灯下，使PMAxx 与样品反应20 min，5 000×g 离心10 min，取上清用于后续RNA 提取。

1.4.1.3 RNA 的提取 按照RNA 提取试剂盒说明，对所有病毒样品进行RNA 提取。

1.4.1.4 荧光定量RT-PCR 荧光定量RT-PCR反应液采用50 μL 体系：25 μL 2×One Step RTqPCR 缓冲液，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，0.8 μL 探针，1 μL DNA 聚合酶，1 μL 逆转录酶，1 μL RNA 模板，并用无RNA 酶水补足至50 μL。荧光定量RT-PCR 反应条件：反转录反应42 ℃、5 min，1 个循环；95 ℃、30 s，1 个循环。PCR 反应95℃、5 s，60 ℃延伸30 s，40 个循环。

1.4.1.5 NoVs 荧光定量标准曲线 利用NovoPro DNA 分子计量程序和公式（1）计算质粒标准品拷贝数[25]。

式中，6.02×1014——阿伏伽德罗常数换算系数；质粒标准品质量浓度为100 ng/μL。

1.4.2 牡蛎样品前处理 牡蛎购买后置于过滤处理的海水中暂养，采用紫外杀菌内循环装置对养殖海水进行灭菌处理。随机选取5 只牡蛎，经RTqPCR 检测无NoVs 后用于试验。选取有活力的牡蛎，用无菌蒸馏水冲洗，吸水纸擦干表面水分，开壳后使用医用手术刀切断闭壳肌，去掉外壳，取出贝肉，在无菌环境取牡蛎消化腺部位，备用。

1.4.3 超高压处理NoVs 样品稀释 每个试验组设置3 组平行和对照组，所有样品均置于冰上保存。

1.4.3.1 牡蛎消化腺匀浆 取50 g 牡蛎消化腺组织，用手持匀浆机进行匀浆处理，吸取2 mL 匀浆液于灭菌真空包装袋内，真空袋内加入20 μL 用0.01 mol/L PBS 缓冲液稀释的GⅡ.4 型NoVs 样品，摇晃使其充分混匀，用封口机封口，GⅡ.4 型NoVs 终浓度为5.0×105copies/μL。

1.4.3.2 NoVs 稀释液 吸取20 μL 用0.01 mol/L PBS 缓冲液稀释的GⅡ.4 型NoVs 样品于灭菌真空包装袋内，加入2 mL 0.01 mol/L PBS 缓冲液，用封口机封口。

1.4.3.3 透射电镜样品 吸取20 μL 未经稀释的GⅡ.4 型NoVs 样品于灭菌真空包装袋内，用封口机封口。

1.4.4 超高压处理 将封装好的样品置于HHP设备腔体中，控制加压初始温度为5 ℃左右，压力大小分别设定为200，300，400，500 MPa，保压时间设定为5 min。HPP 处理后按照1.4.1 节中的方法检测。

1.4.5 透射电子显微镜观察NoVs 形态 用2.5%戊二醛溶液对病毒样品进行固定，将病毒样品滴到蜡板上，把铜网有支持膜的一面与病毒液滴接触，夹起后用滤纸轻轻将铜网边缘多余液体吸干，滴加一滴1%磷钨酸负染色3 min，滤纸吸干多余染液，室温干燥30 min 后上机观察。

1.4.6 丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量测定 称取约0.1 g 牡蛎组织，加入1 mL 提取液进行冰浴匀浆；8 000 ×g、4 ℃离心10 min，取上清，置冰上待测。按照试剂盒说明方法配制样品混合液，100 ℃水浴中保温60 min，置于冰浴中冷却，10 000×g，常温，离心10 min。吸取200 μL 上清液于96 孔板中，测定个样本在450，532 nm 和600 nm 处的吸光度。分别按△A450nm＝A450nm测定-A450nm空白，△A532nm＝A532nm测定-A532nm空白，△A600nm＝A600nm测定-A600nm空白进行计算。

1.4.7 蛋白质巯基含量测定 参照索莱宝巯基含量测定试剂盒说明中的方法进行。

2 结果与分析

2.1 GII.4 型NoVs 荧光定量标准曲线

在NoVs 质粒标准品为102～109copies/μL 范围内，标准曲线线性关系良好，y=-3.0171x +41.109，G Ⅱ.4 型NoVs 样本的浓度为5.0×108copies/μL。

2.2 PMAxx 区分感染性NoVs 效果评价

为了探究PMAxx 是否能有效区分感染性和非感染性NoVs，本试验采用1 000×稀释的GⅡ.4型NoVs（病毒浓度为5.0×105copies/μL），分别进行沸水加热5，10，15，30 min 和湿热灭菌（121 ℃，20 min）处理，而后分别使用PMAxx-RT-qPCR 和传统RT-qPCR 方法进行检测。结果显示，不同加热条件处理后，使用PMAxx-RT-qPCR 的定量值均低于传统RT-PCR 方法，使用PMAxx-RTqPCR 在沸水加热15，30 min 和湿热灭菌条件下均未检出NoVs，而传统RT-qPCR 则均有检出。由于热处理对NoVs 有杀灭效果，在煮沸条件下加热超过15 min NoVs 即可完全失活死亡，不具有感染性，因此传统RT-PCR 具有假阳性的问题。上述结果表明，PMAxx-RT-qPCR 与传统RT-qPCR 相比，可有效检测出感染性NoVs，PMAxx-RT-qPCR方法可用于后续超高压消减NoVs 试验中感染性NoVs 的检测。

图1 GII.4 型NoVs 荧光定量标准曲线Fig.1 The standard curve of fluorescence quantitative of GII.4 NoVs

图2 不同灭活方式下PMAxx-RT-qPCR区分感染性NoVs 效果评价Fig.2 The evaluation of PMAxx-RT-qPCR for distinguishing infectious NoVs under different inactivation methods

2.3 不同压力水平超高压处理对GⅡ.4 型NoVs的影响

由表1可知，对照组牡蛎消化腺匀浆和PBS缓冲液中的NoVs 浓度分别为9.18×104copies/μL和4.10×105copies/μL。经HHP 处理5 min 后，牡蛎消化腺匀浆和缓冲液中的GⅡ.4 型NoVs 浓度均显著降低（P<0.05）；NoVs 减少量随着压力水平的提高而增大。与未处理组相比，PMAxx 处理后牡蛎消化腺匀浆和缓冲液中的可检出的感染性GⅡ.4型NoVs 浓度均减少。400 MPa HHP 处理下缓冲液中的GⅡ.4 型NoVs 浓度降低到检测限（102copies/μL）以下，经过500 MPa HHP 处理后，牡蛎消化腺匀浆和缓冲液中的GⅡ.4 型NoVs 减少量分别超过2.96 lg （copies/μL） 和3.61 lg（copies/μL），牡蛎消化腺匀浆和缓冲液中的GⅡ.4 型NoVs 浓度均降至可检测水平限以下。结果表明HHP 处理可有效消减牡蛎消化腺匀浆和缓冲液中的GⅡ.4 型NoVs。

表1 不同HHP 对GⅡ.4 型NoVs 的消减效果Table 1 The inactivation effect of GⅡ.4 NoVs under different HHP

在200～500 MPa 的HHP 处理下，缓冲液中的NoVs 消减效果优于牡蛎消化腺匀浆中。Ye 等[26]研究发现于6 ℃/500 MPa/5 min 条件下处理的牡蛎匀浆上层清液以及6 ℃/600 MPa/5 min 条件下处理的牡蛎匀浆中的NoVs 浓度均可达到检测限水平以下[19]，与本文的结果类似。通过比较2 种基质中NoVs 拷贝数减少量的差异，可以看出HHP 处理对缓冲液中NoVs 的消减效果比牡蛎消化腺匀浆中的效果好，这可能是因为HHP 处理的效果与食品基质等环境条件密切相关，牡蛎匀浆中含有大量的蛋白质、脂肪等物质，在HHP 处理过程中，这些物质会对NoVs 形成保护作用，保护病毒颗粒不受压力影响，从而降低HHP 处理效果。

在200 MPa HHP 条件下处理5 min 后，与未经HHP 处理的样品相比，牡蛎消化腺匀浆中的NoVs 浓度可减少1.30 lg（copies/μL）；缓冲液中的NoVs 浓度可减少1.68 lg（copies/μL），此压力水平和保压时间下可以实现牡蛎的部分脱壳。研究表明300 MPa HHP 处理下保压1 min，牡蛎脱壳效果最好[27]，而此试验结果显示，300 MPa HHP 下牡蛎中的NoVs 也有显著减少，因此，HHP 技术解决了牡蛎加工中的两大难题，在脱壳的同时又可有效消减体内的病毒。

2.4 不同HPP 压力处理后GII.4 型NoVs 的透射电镜观察

为了探究HHP 处理对NoVs 形态产生的影响，采用透射电子显微镜 （Transmission electron microscope，TEM）观察HHP 处理后NoVs 形态结构发生的改变。结果显示，与未经HHP 处理的GⅡ.4 型NoVs 相比，在200～500 MPa HHP 下处理的GⅡ.4 型NoVs 的边界模糊不清或形状改变，不再呈现一个饱满完整的球形，表明HHP 对NoVs 造成了很大的损害，破坏了病毒衣壳蛋白。由图3看出，GⅡ.4 型NoVs 经HHP 处理后数量明显减少，这与表1结果吻合，NoVs 的消减效果与压力水平大小呈正相关；超高压的作用主要是破坏病毒衣壳和受体结合活性，使得蛋白质挤压变形，暴露出病毒RNA，促使病毒发生降解[28-29]。图3f 为65 ℃加热4 min 处理的NoVs，处理后部分NoVs 出现降解，但大部分NoVs 颗粒仍可保持衣壳蛋白完整，说明65 ℃加热4 min 对NoVs 的消减效果并不显著。

图3 GⅡ.4 型NoVs 透射电镜图Fig.3 Transmission electron microscope image of GⅡ.4 NoVs

2.5 HHP 处理对牡蛎中脂肪和蛋白质的影响

牡蛎肉中的富含多不饱和脂肪酸，容易发生氧化反应。图4a 和4b 分别为HHP 对牡蛎脂肪和蛋白质的影响，可以看出HHP 处理后MDA 含量显著增大（P<0.05），且随着压力水平的增大，脂肪氧化的程度也在增大，这可能是因为牡蛎中铁和铜含量较多，压力可以促进游离金属离子铁和铜的释放，这些离子会促进脂肪的氧化反应。加热处理组比HHP 处理组MDA 值的变化幅度更大，这是因为高温使脂肪发生了很大程度的氧化和聚合。

二硫键是维持蛋白质三级结构及天然构象重要的共价键，断裂会形成巯基，蛋白质巯基含量可以反映蛋白质三级结构的变化情况。由图可知，HHP 和加热处理下，牡蛎蛋白巯基含量均随处理压力和加热时间的增大而增加，HHP 处理组的牡蛎蛋白巯基含量的增幅整体小于加热处理组。HHP 处理组300～400 MPa 下，巯基含量基本不变，说明处理压力大于300 MPa 后，牡蛎蛋白质分子中的二硫键开始断裂产生大量的巯基。

蒸、煮超过15 min，牡蛎中的NoVs 才能得到有效的消减。在HPP 处理下，500 MPa 处理5 min即可使牡蛎中的NoVs 消减到无法检出的水平，在保证NoVs 消减效果的前提下，与加热处理相比，HHP 处理虽使牡蛎发生脂肪氧化和蛋白质变性，在一定程度上降低了牡蛎品质，但对脂肪和蛋白质的负面影响仍远优于加热处理 （如图4c，d 所示）。

图4 超高压和加热处理对脂肪和蛋白质的影响Fig.4 Effects of HHP and heating treatments on fat and protein

3 结论

超高压处理对牡蛎消化腺匀浆和缓冲液中的GⅡ.4 型NoVs 的消减控制效果与压力水平的大小呈正相关。当压力为500 MPa 时，两种基质中NoVs 含量均可降至检测限以下。牡蛎消化腺匀浆中的蛋白质、脂肪等物质在超高压处理对NoVs具有一定的保护作用。超高压处理虽会使牡蛎脂肪的氧化和蛋白质变性，但影响程度远小于加热处理。500 MPa/5 ℃HHP 处理5 min 可将牡蛎中NoVs 消减到无法检出的水平。