基于漂洗工艺的冷冻鱼糜冻藏过程中品质的变化规律

陈 康，张益奇，朱 凯，戴志远*

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州 310012 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州 310012 3 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 辽宁大连 116034）

鲟鱼（Acipenser sinensis）是大型巡回性淡水鱼，我国现有9 个品种，是现存最古老的原始硬骨鱼类。鲟鱼生长迅速，营养丰富[1]。由鲟鱼鱼卵加工而成的鱼子酱具有重要的经济和科研价值。近几年我国鲟鱼养殖业迅速发展，已成为淡水养殖业的重要鱼种之一[2]。然而，鲟鱼的主要经济价值在于其鱼卵，而鲟鱼肉作为鱼子酱的主要副产物未得到充分的开发利用，常制成鱼粉或宠物饲料，造成大量优质鱼肉蛋白和油脂的浪费，限制了鲟鱼产业的发展[3]。

冷冻鱼糜是鱼体经采肉、漂洗、脱水、精滤等加工工序制得的浓缩肌原纤维蛋白，以其为原料生产的鱼丸、鱼饼、鱼肠、模拟蟹棒等各种鱼糜制品，具有高蛋白、低脂肪、无骨刺等优点，深受老年人和儿童的喜爱，市场占有率长期稳定增长[4-5]。利用鲟鱼肉制作冷冻鱼糜可以进一步提升鲟鱼的经济价值，减少鱼肉资源的浪费。鲟鱼属于红肉鱼类，制成的冷冻鱼糜在储藏过程中易发生冷冻变性现象，需在制作过程中进行抑制[6]。本文以西伯利亚鲟鱼肉为原料，研究经漂洗的冷冻鱼糜在冻藏过程中的品质变化，为鲟鱼肉冷冻鱼糜的冻藏保质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西伯利亚鲟鱼，新昌县鲟鳇生物科技有限公司；37 种脂肪酸甲酯标准品，美国Sigma-Aldrich公司；高纯氮气，杭州今工特种气体有限公司；其它化学试剂均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

7890 B 气相色谱仪，美国Agilent 仪器公司；SpectraMax 190 全波长酶标仪，美国Molecular Devices 公司；T-18 均质机，德国IKA 仪器有限公司；Lynx 4000 型高速冷冻离心机、Evolution 60s紫外分光光度计，美国Thermo Fisher Scientific 公司；TMS-Pro 质构仪，美国FTC 仪器有限公司

1.3 方法

1.3.1 冷冻鱼糜的制备[7]取规格相近的新鲜鲟鱼【体长（69.25 ± 5.78）cm，体质量（19.91± 3.66）kg】，去头、去尾去内脏后立即覆冰送至实验室进行采肉。新鲜鱼肉采集后，以4 倍鱼质量的漂洗液进行不同方式的漂洗，每次漂洗时间30 min，漂洗过程中不停搅拌并保持漂洗液温度在10 ℃以下。漂洗后的鱼肉用20 目尼龙滤网离心脱水，使最终样品的含水量为（78±1）%，成型后置于-18 ℃冻藏待测。S1：0.15% NaCl 漂洗一次；S2：冰水漂洗一次，再用0.15% NaCl 漂洗一次；S3：冰水漂洗2次，0.15% NaCl 漂洗一次。

1.3.2 肌原纤维蛋白提取[8]准确称取2.0 g 冷冻鱼糜，加入20 mL 去离子水均质并离心。取沉淀加入20 mL 低盐缓冲液 （50 mmol/L KCl，20 mmol/L Tris-马来酸，pH 7.0）均质并离心。得到的沉淀加入20 mL 高盐缓冲液 （0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-马来酸，pH 7.0）均质后静置提取1 h，离心取上清液既得盐溶性蛋白。取8 mL 盐溶性蛋白，加入32 mL 蒸馏水并离心，取沉淀用0.6 mol/L NaCl溶液溶解，再次离心取上清液，得到的肌原纤维蛋白溶液采用Bradford 法测定浓度，用0.6 mol/L NaCl 调整至4.0 mg/mL，用以进行蛋白质的性质测定。

整个提取过程需采用冰水浴保持0～4 ℃的提取环境，加入的去离子水及缓冲液需在4 ℃冰箱预冷后使用。离心过程采用的离心温度为4 ℃，离心速度为10 000×g，离心时间为10 min。

1.3.3 Ca2＋-ATPase 活性的测定[8]取1 mL 蛋 白溶液，加至9 mL 反应液中形成反应体系（0.5 mol/L KCl，5 mmol/L CaCl2，1 mmol/L 三磷酸腺苷（ATP），25 mmol/L Tris-马来酸，pH 7.0），该体系于30 ℃准确反应10 min 后，立即加入5 mL 15%的三氯乙酸终止反应，混合液10 000×g 离心5 min，测定上清液中的磷含量。以恒重后的磷酸二氢钾为标准品制作无机磷酸盐溶液的标准曲线，用于无机磷的定量分析。取上清液2 mL，加入3 mL 定磷剂 （V蒸馏水∶V20%抗坏血酸∶V3mol/L硫酸∶V3%硫酸钼酸=3∶1∶1∶1），30 ℃发色30 min，于波长640 nm 处测定吸光度值（A）。空白组用0.6 mol/L KCl 替代。Ca2+-ATPase 活性用每毫克蛋白单位时间内产生的磷含量表示【μmol/（min·mg）】。

1.3.4 巯基含量的测定[9]取蛋白溶液1.0 mL，加入9.0 mL 的尿素缓冲溶液【8 mol/L 尿素，1%十二烷基硫酸钠 （SDS），3 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0】，混合均匀后加入1.0 mL 0.1%的5，5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）溶液，震荡后在40 ℃反应25 min，于波长412 nm 处测吸光度，用0.6 mol/L KCl 溶液同时做空白。巯基含量以10-5mol/g 表示，摩尔消光系数为13 600 L/（mol·cm）。

1.3.5 鱼糜蛋白羰基含量测定[8]取1.0 mL 蛋白稀释液，加入1.0 mL 浓度为10 mmol/L 2，4-二硝基苯肼（DNPH），室温避光反应60 min，每隔10 min 振荡1 次。随后加入1.0 mL 20%三氯乙酸终止反应，10 000×g 下离心5 min，弃去上清液。沉淀中加入1.0 mL 乙酸乙酯-乙醇混合液（V∶V=1∶1）洗涤沉淀3 次，去除残留的DNPH。在沉淀中加入3.0 mL 盐酸胍溶液（6 mol/L 盐酸胍、2 mol/L HCl），37 ℃下保温15 min，待沉淀溶解，10 000×g离心5 min，收集上清液波长370 nm 处测定吸光度值。羰基含量表示为nmol/mg，摩尔消光系数为22 000 L/（mol·cm）。

1.3.6 表面疏水性测定[10]取1.0 mL 蛋白溶液，加入200 μL 1 mg/mL 溴酚蓝，震荡反应30 min后，4 000×g 离心5 min。稀释10 倍后，测定波长595 nm 处的吸光度值，以溴酚蓝的结合量作为表面疏水性值。

溴酚蓝结合量（μg）=（A空白-A样品）×200/A空白

1.3.7 硫代巴比妥酸反应值（TBARS）测定[11]取2.0 g 样品研碎，加入20 mL 7.5%三氯乙酸，振荡30 min，10 000×g 20 ℃离心10 min，取上清液5.0 mL，加入5.0 mL 0.02 mol/L 的硫代巴比妥酸（TBA）溶液，于90 ℃保温30 min，流水冷却至室温后5 000×g 离心，取上清液于波长532 nm 处测定吸光度，同时以7.5 g/mL 三氯乙酸作空白，以1，1，3，3-四乙氧基丙烷为丙二醛标准品，硫代巴比妥酸反应物（TBARS）值以单位样品中丙二醛的含量表示（mg/kg）。

1.3.8 脂肪酸组成测定 参照Bligh 等[12]的方法。取4.0 g 鱼肉完全绞碎，加入12 mL 氯仿-甲醇（V氯仿∶V甲醇=2∶1）混合液均质3 min，再超声提取20 min，8 000×g 离心15 min 后，取下层氮吹得粗油脂。在提取油脂中加入5.0 mL 0.5 mol/L KOH-甲醇溶液，于65 ℃水浴20 min，振摇至油滴消失并冷却。加入0.6 mL 50%三氟化硼-甲醇溶液，于65 ℃水浴5 min，超声提取10 min 后加入2.0 mL正己烷，振摇后用2.0 mL 饱和NaCl 淋洗，1 000×g离心取上层用无水硫酸钠脱水，过滤待测。采用峰面积归一化法分析各脂肪酸组分的相对含量。每组样品重复测试3 次。

气相色谱条件[13]：HP-INNOWAX 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.15 μm）；升温程序：初温50℃保持2 min，后以4 ℃/min 升至250 ℃，保持15 min；进样口温度为250 ℃，分流比40∶1，进样量1 μL，载气流速为0.65 mL/min。

1.3.9 鱼糜制品质构特性[14]冷冻鱼糜4 ℃半解冻后，加入2.5% NaCl 斩拌3 min，填充至折径45 mm 的尼龙肠衣中，打扣制成50 mm 长的鱼肠。鱼肠置于45 ℃凝胶化60 min，再于90 ℃熟化30 min，熟化后立即置于冰水中冷却30 min，将鱼糜切成30 mm 厚的圆柱体用以进行质构测定。TPA方法测定鱼糜制品的质构特性，采用5 mm 球形探头，穿刺速度1 mm/s，形变量50%。凝胶强度（g·mm）以破断力（g）与凹陷深度（mm）的乘积表示。

1.4 数据处理

采用Excel 2013 和SPSS 22 进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 冷冻鱼糜冻藏期内活性巯基、羰基、表面疏水键含量的变化

活性巯基、羰基、表面疏水键含量是蛋白质氧化的重要特征之一，直接反应蛋白质性质变化[15]。不同漂洗次数冷冻鱼糜在冻藏期间的活性巯基、羰基、表面疏水键含量变化如表1所示。在90 d的冻藏期间，3 组冷冻鱼糜的活性巯基含量都显著下降，羰基和表面疏水键含量显著上升。由表1可知，增加漂洗次数可以抑制冷冻鱼糜在冻藏期间的活性巯基含量下降。冷冻鱼糜活性巯基下降的主要原因是冻藏过程中肌原纤维蛋白发生结构变化，活性巯基氧化形成二硫键。相关研究表明[16]，漂洗工艺可以洗脱鱼肉中含有的促蛋白变性的成分，如Ca2+、Mg2+等。同时，漂洗工艺可以有效去除鱼肉中的色素、水溶性蛋白等，减少冷冻过程中肌原纤维蛋白的活性巯基基团暴露，抑制活性巯基的氧化。

随着冻藏时间延长，冷冻鱼糜中羰基含量都快速上升，而漂洗工艺可以显著抑制这种变化。冻藏过程中，3 组冷冻鱼糜羰基含量都从储藏开始就呈线性上升趋势，其中S1 组冷冻鱼糜羰基含量上升较快，S3 组上升最慢。相关研究表明[17]，冷冻鱼糜中羰基含量的增加会引起肌原纤维蛋白的聚集与破裂，进而改变肌原纤维蛋白的构象，导致蛋白性质变化以及功能性丧失。羟自由基、氧化多肽碎片以及脂质氧化产物都会导致蛋白质氨基酸残基转化为羰基。

由表1可知，冷冻鱼糜在冻藏期间表面疏水键含量呈现不断上升趋势。15 d 开始，3 组冷冻鱼糜表面疏水性呈现显著差异趋势。S1 组冷冻鱼糜在冻藏15 d 后表面疏水性持续上升，而S2 组和S3 组增长趋势较平缓。研究表明[18]，漂洗工艺可以减缓冷冻鱼糜肌原纤维蛋白在冻藏过程中的氧化变性，这可能是由于漂洗过程既可以减少鱼肉中易氧化的不饱和脂肪酸含量，又可以减少水溶性蛋白酶含量，防止肌原纤维蛋白的结构破坏。

表1 漂洗次数对冷冻鱼糜冻藏期内活性巯基、羰基、表面疏水键含量的影响Table 1 Effect of rinsing times on the contents of active sulfhydryl，carbonyl group and surface hydrophobicity of surimi during frozen storage

（续表1）

2.2 冷冻鱼糜冻藏期间Ca2+-ATPase 活性变化

Ca2+-ATPase 活性可以直接反应冻藏过程中肌原纤维蛋白活性的变化，同冷冻鱼糜的凝胶强度呈正相关，也是体现冷冻鱼糜质量特性的重要指标之一[19]。由图1可知，随着冻藏时间的增加，肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase 活性下降，最终趋于平缓。冻藏初始阶段，冷冻鱼糜Ca2+-ATPase 活性随着漂洗次数的增加而下降，这可能是由于漂洗后需要进行脱水处理，脱水过程中冰水同鱼肉分离，鱼肉温度随之上升，而肌原纤维蛋白在温度升高时容易相互聚集形成大分子蛋白质，从而导致肌原纤维蛋白的活性下降。随着冻藏时间的增加，S1组和S2 组冷冻鱼糜Ca2+-ATPase 活性下降，于60 d 时基本失去活性，而S3 组冷冻鱼糜在第60 天时还保持有一定的活性，这表明漂洗工艺可以有效保持冷冻鱼糜在冻藏过程中的肌原纤维蛋白活性。

图1 漂洗次数对冻藏期间冷冻鱼糜Ca2+-ATPase活性的影响Fig.1 Effect of rinsing times on Ca2+-ATPase activity of surimi during frozen storage

2.3 冷冻鱼糜冻藏期间盐溶性蛋白含量的变化

由图2可知，冷冻鱼糜的盐溶性蛋白含量随着冻藏时间的增加而下降，表明冻藏过程会引起肌原纤维蛋白变性。漂洗工艺可以去除鱼肉中的水溶性蛋白、色素及其它杂质，相对提高盐溶性蛋白含量。随着冻藏时间增加，S3 组冷冻鱼糜的盐溶性蛋白含量下降趋势显著高于S2 组冷冻鱼糜，分别为36.85%和33.98%。这可能是由于S3 组冷冻鱼糜盐溶性蛋白含量提高，增加了其氧化变性的程度，并且冷冻过程形成的冰晶更容易对盐溶性蛋白结构造成破坏。由此可知，过度的漂洗工艺反而会引起肌原纤维蛋白在冻藏过程中的损耗。

图2 漂洗次数对冻藏期间冷冻鱼糜盐溶性蛋白的影响Fig.2 Effect of rinsing times on salt-soluble proteins of surimi frozen storage

2.4 冷冻鱼糜冻藏期间脂质氧化状态

由图3可知，冷冻鱼糜在冻藏期间TBARS 值不断上升，冻藏起始阶段，冷冻鱼糜TBARS 值增加较为缓慢，从30 d 开始快速上升，S1 冷冻鱼糜TBARS 值最高，S3 组最低。丙二醛是多不饱和脂肪在氧化过程中的产物，因此TBARS 值可以反映冷冻鱼糜在冻藏期间脂肪的氧化情况。由图3可知，随着漂洗次数的增加，冷冻鱼糜在冻藏期间的脂质氧化呈减缓趋势。鱼肉组织脂肪含量高，富含不饱和脂肪酸，在冻藏过程中易发生氧化作用，漂洗工艺可以显著降低冷冻鱼糜中的脂肪含量，避免了冷冻鱼糜在冻藏过程中脂质的快速氧化。

图3 漂洗次数对冷冻鱼糜冻藏期间TBARS 值的影响Fig.3 Effect of rinsing times on TBARS value of surimi during frozen storage

2.5 冷冻鱼糜冻藏期间脂肪组成的变化

图4为不同漂洗次数冷冻鱼糜在冻藏期间二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）相对含量的变化趋势，由于DHA 和EPA 不饱和程度相似，因此变化趋势基本相同。由图4可知，3 组冷冻鱼糜DHA 和EPA 的相对含量在冻藏期间都经历了先上升后下降的过程，结合TBARS 值可以推测这可能是由于冷冻鱼糜在冻藏初期不带有DHA 和EPA 的甘油酯先开始氧化，导致EPA 和DHA 相对含量增加，EPA 和DHA 于15 d 开始迅速氧化。由图4a 可知，尽管S3 组冷冻鱼糜初始DHA 相对含量较高，然而在储藏过程中氧化速率高于其它两组，自60 d 开始DHA 相对含量已低于其它两组冷冻鱼糜。由图4b 可知，S3 组冷冻鱼糜的EPA 相对含量一直保持较高的水平，然而随着冻藏时间的增加，3 组冷冻鱼糜的EPA 相对含量差异减少。由此可知，尽管不饱和脂肪酸在低温条件下氧化速率降低，但在长时间的冷冻条件下，氧化程度也能积累到较高水平。因此，冷冻鱼糜在冻藏过程中也应关注脂肪酸的氧化损失，尤其是在制作少漂洗冷冻鱼糜过程中。

图4 漂洗次数对冻藏期间冷冻鱼糜DHA（a）和EPA（b）相对含量的影响Fig.4 Effects of rinsing times on the relative contents of DHA （a） and EPA （b） in surimi during frozen storage

2.6 冷冻鱼糜冻藏期间质构特性变化

由图5可以看出，初始的破断力、凹陷深度和凝胶强度都随着漂洗次数的增加而升高，在冻藏过程中随时间延长而下降，逐步失去凝胶形成能力。S1 组冷冻鱼糜在冻藏期间凝胶强度最低，并且在30 d 时基本失去了凝胶形成能力。S3 组冷冻鱼糜虽在冻藏期间凝胶强度保持最好，但也于60 d 基本失去凝胶能力。相关研究表明[20]，冷冻鱼糜在冻藏过程中肌原纤维蛋白会发生降解，而肌原纤维蛋白是鱼糜凝胶形成的决定性因素。魏跃胜等[21]指出，淡水鱼发生冷冻变性的程度远远高于海水鱼。本研究所使用的鲟鱼肉为淡水鱼肉，在冷冻条件下更易发生冷冻变性，因此更需要添加抗冻成分延长其储藏期。

图5 漂洗次数对冻藏期间冷冻鱼糜破断力（a）、凹陷深度（b）和凝胶强度（c）的影响Fig.5 The influence of rinsing times on the breaking force （a），deformation （b） and gel strength （c）of surimi during frozen storage

3 结论

冻藏过程中冷冻鱼糜的活性巯基和Ca2+-ATPase 快速下降、羰基和表面疏水性快速上升，表明冻藏过程中冷冻鱼糜蛋白质发生氧化、空间结构发生变化导致内部疏水基团暴露，蛋白质活性降低，而漂洗工艺可以有效延长蛋白质的冷冻变性时间。冻藏过程中鲟鱼鱼糜的脂肪也在不断氧化，TBARS 值自冻藏初始即快速上升，而漂洗工艺可以延缓脂肪酸的氧化。结合TBARS 值和气相分析结果，发现冻藏初期DHA 和EPA 氧化程度相对较低，冻藏中期开始迅速氧化。质构分析进一步证明，漂洗工艺可以抑制冻藏过程中冷冻鱼糜的蛋白结构劣化，因此在研究减少鱼糜漂洗工艺时需关注其冷冻变性过程。