同时检测食品中多种类真菌毒素的研究进展

戴海蓉，梁思慧，王春民，许 茜，3*

（1 苏州市疾病预防控制中心 江苏苏州 215100 2 东南大学公共卫生学院 南京 210009 3 东南大学 环境与医学工程教育部重点实验室 南京 210009）

1 食品中真菌毒素污染及危害的特点

真菌毒素是由真菌在适宜环境条件下产生的一系列有毒次生代谢产物，膳食是机体摄入真菌毒素的主要方式[1]。食品中检出率较高的真菌毒素主要由曲霉菌属（Aspergillus）、青霉菌属（Penicillium）以及镰刀菌属（Fusarium）等菌属产生[2]，包括黄曲霉毒素 （Aflatoxin，AFT）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）、杂色曲霉素（Sterigmatocystin，ST）、展青霉素（Patulin，PAT）、伏马菌素（Fumonisin，FB）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON）、雪腐镰刀菌烯醇（Nivalenol，NIV）、T-2 毒素等[3]。根据其主要产毒菌属和化学结构可对其分类，结果见表1。

大量研究表明，摄入真菌毒素可对机体产生免疫、生殖、肝、肾及DNA 损伤等多种毒性[19]，且在低浓度真菌毒素暴露（μg/kg 水平）即可致肝脏、肾脏和胃肠道病变，甚至可致癌、致畸、致突变等[20]。OTA、FB、DON、ZEN 和PAT 的暂定每日最大耐受量 （Provisional maximum tolerable daily intake，PMTDI）仅为17.1 ng/kg，2，1，0.5 μg/kg 和0.4 μg/kg[21-22]，这提示不能因为其低水平的污染而忽略其潜在毒性。AFB1作为已知的化学物质中致癌性最强的一种，被国际癌症研究所（IARC）归为1A 类致癌物[23]。OTA 和FB 均被认定为2B 类致癌物，其它一些真菌毒素，如FUSX、CIT、DON、NIV、PAT、ZEN、T-2 和PA 等亦具有致癌性[24]。据联合国粮食及农业组织（FAO）报道，全球至少25%的粮食作物受到真菌毒素的污染，其中约2%失去营养和经济价值[25]，造成全球数百万美元的经济损失[26]。根据2006-2016年间全球报告数据显示，原粮中AFT、OTA、FB、DON 和ZEN 的样本阳性率分别为55%，29%，61%，58%和46%[27]。作为以大米、小麦、玉米、花生等为主要粮食经济作物和食品原料的农业生产大国，我国同样也饱受真菌毒素污染问题的困扰[28]。除水稻、小麦、玉米、燕麦、高粱等粮食作物外[27]，大豆、油菜籽、花生等油料作物及食用油制品[6]，苹果、柑橘、番茄等蔬果及其制品[29]，酱油、食醋、花椒等调味品[30]，啤酒、葡萄酒等发酵品[31]以及肝、肾、肌肉、乳汁及禽蛋等动物源性食品中均广泛存在真菌毒素的污染[7]。

如表1所示，食品中广泛存在真菌毒素的污染，且一种食品中通常存在多种毒素共同污染[32]。Streit 等[33]对来自欧洲、美国和澳大利亚的83 份玉米、小麦、大麦和饲料样品进行分析，发现所有样品均被7～69 种真菌毒素或其毒性次生代谢产物共同污染。这是由于大多数真菌产毒具有非单一性的特点，即一种真菌能够同时产生几种真菌毒素，而同一种毒素也可由多种真菌产生[34]，因此多种类真菌毒素同时污染食品的情况非常普遍。当多种真菌毒素同时存在时，常有毒性加成或协同作用而展现出比单一毒素更大的毒性作用[35-37]，又因大多数真菌毒素化学性质稳定，对热处理、酸处理或者紫外处理等具有不同程度的抗性[38]，普通的食品加工和制备过程无法完全破坏其毒性[39]，使真菌毒素污染食品所致的健康危害更为堪忧。

表1 常见的真菌毒素类别及其产毒菌属和污染的主要食品Table 1 Classification of common mycotoxins and their toxigenic bacteria and contaminated food

面对食品中普遍存在多种类型的真菌毒素共同污染的现实，同时监测其中多种类真菌毒素的污染状况，对于及时发现食品安全隐患，切实保障食品安全具有重要意义。食品安全监测的样品数量巨大而且性质各异，如何快速、高效地同时检测其中的多种类真菌毒素，是实际工作面临的主要挑战。本文将从样品前处理方法和检测技术两个方面介绍食品中多种类真菌毒素同时监测的研究进展（表2）。

2 同时提取和净化多种真菌毒素的样品前处理技术

食品中的真菌毒素往往以较低的含量水平（μg/kg）存在于复杂的、大量的基质成分中，为保证分析结果的灵敏度、准确度和精密度，必须进行样品前处理以净化基质、富集目标物[92]。由于各种真菌毒素化学结构不同、物理性质各异，且在实际样品中含量水平相差较大，因此为了同时检测食品中的多种类真菌毒素，亟需研发同时高效提取多种类真菌毒素的前处理技术。如表2所示，目前同时提取、净化多种真菌毒素的样品前处理方法多为液液萃取（Liquid-liquid extraction，LLE），固相萃取（Solid-phase extraction，SPE），免疫亲和柱法（Immunoaffinitycolumn，IAC）和QuECHERS法（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）。

表2 同时监测多种类真菌毒素的样品前处理及检测方法Table 2 Sample pretreatment and detection methods for simultaneous monitoring of multiple mycotoxins

（续表2）

（续表2）

由于绝大部分真菌毒素易溶于乙腈、甲醇等极性有机溶剂，在这些溶剂中加入少量的水，可以润湿样品基质，增强有机溶剂在样品中的渗透能力，有利于提高萃取效率，再加入适当的酸，则有利于对酸敏感的真菌毒素的提取且一定程度上会降低基质效应。因此，常用酸化的乙腈-水或者甲醇-水溶液实现对多种真菌毒素的提取[93]。LLE 法常需将固体样品制成样品溶液[41]或者直接对母乳[40]、牛乳[42]、食用油[43]等液态样品进行提取，并通过低温或者石油醚、己烷等非极性溶剂去除油脂或其它非极性杂质。例如，针对玉米、大米、小麦样品的甲醇-水提取液，利用三氯甲烷进行两次LLE处理可以净化样品中的基质，实现AFT 和OTA 的同时富集与纯化[41]。EOM 等以酸化的乙腈提取大豆油、玉米油中4 种AFT、3 种FB、OTA、ZEN、DON、T-2 等6 类共11 种真菌毒素后，使用正己烷进行脱脂，实现了净化[43]。LLE 方法虽然操作简单，但若要同时高效提取多种真菌毒素，须对萃取剂类型及其与水的比例进行繁复的优化，且LLE法有机溶剂使用量大，处理单个样品常会用到十几毫升的有机溶剂[43]，在处理的样品数量较大时，其不利于环保的问题更加凸显。

分散液液微萃取 （Dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME） 作为一种新型的LLE，具有成本低、溶剂使用量少和富集效率高等优点[94]，通过分散剂的作用，萃取剂与样品充分接触，可以大大提高真菌毒素的提取效率，同时显著减少有机溶剂的用量。在涡旋辅助条件下，同时提取、富集黄酒中AFT、ST、OTA、MPA 等4 类共8 种真菌毒素时仅需800 μL 萃取剂 （二氯甲烷）和866 μL 分散溶剂（乙腈）[44]。Han 等[45]采用酸辅助的DLLME 法，仅用60 μL 萃取剂（三氯苯胺）以及1 500 μL 分散剂（HCL），即可实现对果汁中AFT、OTA、CIT 和链格孢霉毒素等4 类共8 种真菌毒素的富集、净化。DLLME 虽较LLE 在减少有机溶剂使用量方面有了进步，但单位时间可同时处理样品的数量，即样品处理通量，仍有待提高。

SPE 作为一类重要的样品前处理技术，通过固相吸附剂与目标物或杂质的结合，从而达到富集或净化样品的效果，可以结合12 位、24 位或96孔板商品化固相萃取仪，同时处理12、24 或96 个样品，较之LLE 和DLLME 等液相萃取法，其处理样品通量较高，可显著提高检测工作的效率。Deng等[95]和Li 等[96]采用96 孔SPE 法分别建立了同时净化处理 NIV、DON、3-ACDON、15-ACDON、DON-3G、DOM-1 和ZEN、ZAN、α-ZEL、β-ZEL、α-ZAL、β-ZAL 的高通量样品处理方法。目前在多种类真菌毒素的检测中，SPE 法更多地是被应用于吸附杂质以净化样品，收集SPE 小柱流出液进行后续分析，且多采用商品化的SPE 小柱。例如，C18 柱可以吸附茶叶中的基质，用于茶叶中AFT、OTA、FB、ZEN、ST、CIT、A/B 类单端孢霉烯族毒素、链格孢霉毒素、恩镰孢霉毒素等10 类共42 种真菌毒素多残留的净化[82]，以极性、非极性及离子交换树脂等作为复合吸附材料的Myco Sep 226多功能净化柱可用于花生油和玉米油中AFT、ZEN、FB、A/B 类单端孢霉烯族毒素等5 类共13种真菌毒素的同时净化[48]。Oasis PRi ME HLB 柱可以吸附液态乳样品溶液中的干扰物，使真菌毒素与样品基质分离，直接收集流出液即可对其中的AFT、OTA、FB、ZEN、ST、CIT、A/B 类单端孢霉烯族毒素等8 类共14 种真菌毒素进行检测，使用时无需进行SPE 柱的活化和平衡，样品溶液经过该柱后亦无需淋洗，大大简化了样品处理过程[46]。王蒙等[49]将亲水亲脂平衡（Hydrophilic-lipophilic balanced，HLB）与混合模式阳离子交换（Mixedmode cationic exchange，MCX）2 种填料混合作为吸附填料自制了SPE 柱，实现了对果蔬样品基质中干扰物的有效吸附，建立了同时净化并检测包括OTA、CIT 和链格孢霉毒素等在内的共5 类真菌毒素的方法。

采用SPE 法亦可吸附并富集食品中的真菌毒素，Mccullum 等[97]研制的聚多巴胺涂层的Fe3O4纳米颗粒和Dong 等[98]研制的多壁碳纳米管能分别吸附AFT 或A 类单端孢霉烯族毒素等真菌毒素。涂覆有双层SiO2的Fe3O4纳米颗粒[52]和氨基修饰的磁性多壁碳纳米管[53]均可以作为有效的真菌毒素吸附剂，分别可以实现对植物油中FB1、ZEN 和OTA[52]以及小麦中AFB1 和ZEN[53]的同时富集，且这些磁性吸附剂与传统的C18和N-丙基乙二胺（Primary secondary amine，PSA） 吸附剂相比，不仅提高了目标物的富集效率，还可利用磁性实现固液两相的快速分离，缩短了样品预处理时间。然而，由于各类真菌毒素结构和性质各不相同，目前的SPE 法仍存在对部分类别的真菌毒素吸附作用较弱、回收率低的问题。吸附剂作为SPE 技术的核心，可以对其进行多种功能化修饰，使其可依据疏水作用、π-π 键作用、静电力、氢键等不同的作用机理实现对多种真菌毒素的同时高效吸附。

QuECHERS 法是在多种真菌毒素同时检测中应用较为广泛的样品前处理方法。该方法是一种将提取与净化结合的快速样品前处理方法，它通过乙腈对样品进行提取后，向提取液中添加无机盐，使水相和有机相盐析分层，随后向其添加吸附剂结合杂质，从而达到净化、富集目的，类似于LLE 与SPE 的结合使用。该法最初多用于农药分析，对试剂类型、用量和比例进行优化后在多种真菌毒素的同时提取、净化中的应用日益广泛[99]。在应用于真菌毒素的提取、净化时，通常在乙腈中添加适量酸，以使含较多羧酸基团的OTA 和FBs 保持其分子形式，更易于提取，从而保证较高的回收率[100]；随后加入无水硫酸镁去除有机相中的水分，加入氯化钠促使各种真菌毒素进入有机相而将基质干扰物保留在水层，最后利用C18、PSA 或石墨化碳黑（Graphitized carbon black，GCB）等吸附剂除去有机相中的糖、脂质、有机酸和色素等，进一步达到净化的目的。Colli 等[58]利用QuECHERS法在同时提取、净化燕麦样品中的AFT、OTA、ST、PAT、FB、ZEN、链格孢霉毒素、A/B 类单端孢霉烯族毒素和恩镰孢霉毒素等10 类共42 种真菌毒素时结合了机械辅助，通过实现震荡步骤的自动化提高了工作效率，可使每人每日分析样品数达60～70 个。

QuECHERS 法仍存在一定的局限性，如其常用的吸附剂中，PSA 易吸收FB1和FB2等酸性真菌毒素，而GCB 则易于吸附具有平面结构的真菌毒素，例如AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和ST，造成对这些目标物的回收率较低，不利于灵敏检测[58，101]，无法完全适用于婴幼儿食品等真菌毒素限量要求较严格的样品分析[102]。QuECHERS 与其它方法联合使用，或可更好地达到同时富集、净化多种类别真菌毒素的目 的。Bessaire 等[59]将QuECHERS 法与免疫亲和柱法（Immunoaffinity column，IAC）联合使用，可对食品中AFT、OTA、ZEN、FB、A/B 类单端孢霉烯族毒素等6 类共12 种真菌毒素进行多残留分析，方法灵敏度满足可对婴幼儿食品安全检测的要求。

IAC 法基于抗原抗体特异性结合原理，通过在IAC 柱中填充键合了真菌毒素特异性抗体的填料，当样品提取液通过色谱柱时，其中的真菌毒素即与填料上键合的抗体特异性结合而被富集，并与样品基质分离。串联IAC 将多个单克隆抗体IAC 柱连接使用，复合IAC 则将多种真菌毒素单克隆抗体共同键合在填料上，制成多抗体免疫亲和柱，两者均能实现对多种真菌毒素的同时净化与富集，改善了传统IAC 只能提取单一真菌毒素的局限，展现出良好的应用前景[61]。通过串联使用IAC，能够实现对粮食样品中OTA 和ZEN[103]以及谷物、动物饲料和婴儿食品中AFT、OTA、FB、ZEN、A/B 类单端孢霉烯族毒素等6 类共11 种真菌毒素的同时净化与富集[62]。IAC 与SPE 的联合使用可实现茶叶中AFT、OTA、ZEN、FB、A/B 类单端孢霉烯族毒素等6 类共10 种真菌毒素的同时净化，有效减少了杂质的干扰[61]。此外，Zhang 等[60]利用聚苯乙烯-二乙烯基苯作为抗氧化剂，制备了含有ZEN，DON，T-2 和HT-2 4 种毒素抗体的复合IAC 柱，用于面粉样品的前处理。IAC 法对目标物分离纯化时具有高特异性、高富集程度的优点，可以高选择性地去除样品基质中的干扰物，也是我国现行的各种行业标准、地方标准和国家标准中多采用的方法（如表3所示）。然而，IAC 柱在使用时需多次淋洗及洗脱，过程中还需控制流速，较为繁琐、费时，试剂消耗也较多。为实现多种类的真菌毒素同时提取，需要在填料上固定不同类型的抗体，导致IAC 柱的制备成本较高，且使用期限短，保存条件要求高，这些都限制了IAC 法的广泛应用。

3 同时检测多种类真菌毒素的方法

如表3所示，目前可实现多种类真菌毒素同时检测的方法主要分为2 类：免疫分析法和色谱法。

3.1 免疫学分析法

免疫学分析法常使用胶体金、量子点、酶和荧光素等标记抗体或抗原，通过抗原抗体特异性结合后产生荧光强度的改变对真菌毒素进行检测。曹德康等[66]通过将3 种胶体金试纸条组装成三联检测卡实现了对谷物中AFB1、ZEN、DON 的同时检测。在检测多种目标分析物时，若使用单色标记的免疫层析试纸会出现多个相同颜色的条带不易分辩的问题，Duan 等[67]基于微乳液技术，以不同比例将两种发射波长分别为575 nm 和615 nm 的CdSe/ZnS 量子点进行封装，合成了3 种不同颜色的量子点 （黄绿、橙色和红色），并将其分别与ZEN、OTA、FB1单克隆抗体偶联，采用量子点荧光免疫法实现了玉米中ZEN、OTA、FB1的同时检测。此外，通过在生物芯片上固定酶标记的真菌毒素特异性抗体，当真菌毒素与酶竞争结合抗体时导致荧光信号发生改变，也可实现多种真菌毒素的同时检测[68]，目前已被应用于水中AFB1、AFM1、DON、OTA、T-2、ZEN 的检测[69]以及饲料中AFB1、AFG1、FB1、OTA、DON、T-2、ZEN 的半定量筛查[71]。

基于免疫学原理的检测法具有特异性强、灵敏度高的优点，因此样品前处理较为简单，仅需将样品经有机试剂提取后，经离心、稀释即可直接进行检测，无需进一步的净化过程（见表2）。然而，该法存在着仅可定性或半定量分析的局限性，且因真菌毒素相对分子质量低且仅含单个抗原决定簇，属于半抗原，其抗原性较弱，使得制备抗体的成本较高。

3.2 色谱法

高效液相色谱法 （High performance liquid chromatography，HPLC）作为一种分离方法，常常配备荧光检测器（Fluorescence detector，FLD）进行AFT、OTA 等自身具有荧光基团的真菌毒素的检测[104]，我国现行标准即多用HPLC-FLD 检测食品中的AFT（见表3）。一些真菌毒素自身不具有荧光基团（如FB），或在进行反相色谱分离过程中会发生荧光猝灭（如AFT、OTA 等），常使用柱前或柱后衍生使其生成有荧光的衍生物，从而提高检测灵敏度[105]。传统的化学柱前或柱后衍生化法常需要用到有毒和腐蚀性的化学试剂，需要额外的泵和检测池，且形成的衍生物可能会造成干扰。光化学衍生法利用紫外光辐射对真菌毒素进行衍生化，可克服这些缺点。Irakli 等[75]在HPLC 柱后连接光化学反应器进行光化学衍生后，以FLD 同时检测了麦麸中的AFT、DON、OTA 和ZEN。Lee 等[106]也应用光化学衍生来增强饲料中的AF、OTA 和ZEN 荧光。然而，由于可采用化学或光化学方法进行荧光衍生的真菌毒素种类较少，因此HPLCFLD 的应用也比较有限。

表3 我国对多种真菌毒素同时检测的现行标准Table 3 Current standards for simultaneous detection of multiple mycotoxins in China

（续表3）

色谱与质谱联用法结合了色谱高效的分离能力和质谱优越的检测能力，在真菌毒素检测方面得以广泛应用。气相色谱-质谱法 （Gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS）可定量检测挥发性的真菌毒素，如玉米赤霉烯酮类、A/B 类单端孢霉烯族类真菌毒素[84]。然而，由于大部分真菌毒素沸点较高，挥发性较弱，极性较强，因此在GC-MS 检测时常需要先进行衍生化，将真菌毒素转化为更具挥发性，极性较小且热稳定的衍生物[107]。高效液相色谱-串联质谱法（High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）和超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）不受真菌毒素挥发性和热稳定性的制约，兼之得益于高分辨二级质谱强大的定性及定量检测能力，仅需以有机试剂对样品进行简单的提取，经稀释后即可进行定性、定量分析，甚至可以进行多组分非靶标性鉴定，成为目前同时检测多种类真菌毒素的主流方法，其中三重四极杆（Triple quadrupole，QQQ）和四极杆串联高分辨率的飞行时间（Quadrupole-time of flight，QTOF）检测器被广泛使用。研究者们通过对啤酒样品进行QuECHERS 处理去除糖、色素或有机酸等多种杂质后，采用UPLC-MS/MS（QQQ）对啤酒中AFT、ZEN、FB、OTA、A/B 型单端孢霉烯族毒素以及恩镰孢霉毒素等7 类共23 种真菌毒素进行同时定性和定量分析[76]，采用UPLC-MS/MS（QTOF）实现了饲料[78]和小麦[80]中真菌毒素多目标、非靶标性的测定。HPLC-MS/MS 和UPLC-MS/MS 已然成为同时高效检测目前食品中多种类真菌毒素的主流方法。

3.3 实时直接分析（DART）技术与质谱技术的联用

实时直接分析（Direct analysis in real time，DART）是2005年由Cody 教授等[78]发明的非表面接触的热解吸和离子化技术，是目前商品化最为成功的新型原位电离技术之一，与高分辨率质谱仪结合后形成的DART-MS 法具备快速、实时、直接分析的能力。不同于色谱-质谱检测技术，DART-MS 技术不需要前端的色谱分离过程，样品中的目标物分子可直接由DART 离子源在常压下电离后即刻进行MS 分析。该方法尤其适于多个目标物的同时检测，具有近乎实时的高通量检测的特点[108]。DART-MS 已被应用于各种食品样品中违禁药品、活性成分、兽药、农药的高通量筛查，近年也开始用于食品中真菌毒素的检测，然而，在多种类真菌毒素同时检测方面还少见报道[109-110]，目前仅见Vaclavik 等[91]将DART 与超高分辨力Orbitrap MS 结合，尝试对小麦和玉米中多种真菌毒素进行检测。采用QuECHERS 法对目标物提取、净化后，评估了DART 技术对真菌毒素的电离效率，发现T-2、HT-2、AFB1、AFM1等电离较弱，极性较大的FB、OTA、DON-3G 和麦角生物碱较难电离，致使MS 在检测这些目标物时灵敏度不够、或不可行，推测DART 电离效率可能会受真菌毒素的极性和分子质量等影响，最终以DART-MS法对11 种电离效率高的真菌毒素（DON、NIV、ZEN、3-ACDON、DOM-1、FUSX、ALT、AOH、AOHCH3、DAS 和ST）进行快速定量分析。在此研究的基础上，Busman 等[111-113]优化了DART 使用时分析物板和氦等离子体发射器的位置、电离气体温度、氦等离子体发射器的栅极电压等参数后，提高了DART 对AFB1、T-2 和HT-2、AFM1的电离效率，并将建立的DART-MS 方法应用于玉米、牛奶等实际样品的检测。若在提高真菌毒素的电离效率方面有更大突破，DART-MS 将具有很大的应用潜力。

4 总结与展望

食品中广泛存在多种类真菌毒素的共同污染，必须高效、快速地进行多种真菌毒素的同时检测，以全面、准确地评估健康风险。目前的免疫学方法已不再局限于单一真菌毒素的检测，可以做到多达6 个种类真菌毒素的同时检测。UPLC 和HPLC-MS/MS 成为食品中真菌毒素多残留分析应用最广泛的技术，在高分辨率质谱的发展带动下，已可对痕量水平的多种真菌毒素进行同时定性与定量检测，甚至可以在无需标准物质的情况下进行非靶标性测定，展现出独特的优势，成为食品中多种真菌毒素同时检测的主流方法。发展DARTMS 等新型高通量检测技术在食品中多种类真菌毒素检测中的应用，具有重要的意义。

研发能同时提取多种类型真菌毒素的样品预处理技术仍然是瓶颈问题，常用的LLE 法、SPE法、QuEChERS 法、IAC 法等仍存在使用有机溶剂过多、多种真菌毒素共存时不能完全吸附或抗体制备成本高等局限性。此外，针对不同样品基质常需要各种不同处理方法，然而，现行标准和检测方法适用的样品范围较为单一。面对检测样品数量巨大、样品类型繁多的现实情况，亟待研发适用于各类食品的、可同时高效净化、富集不同目标物的预处理新技术，结合后续的高通量分析方法，方可真正实现食品中多种类真菌毒素的高效、高通量检测。