海洋源降血压肽研究进展

胡学佳，戴致远，张晓頔，叶 剑

（浙江工商大学海洋食品研究院 杭州 310035）

随着社会的发展，焦虑和压力的与日俱增，高血压患者人数呈现逐年递增的趋势。据世界卫生组织统计，在2020年非传染性疾病类别中，高血压等心血管疾病患病人数占较大比例，2025年，高血压人口预计增加到15.6 亿[1]。高血压是一种常见的慢性医学疾病，主要分为原发性高血压和继发性高血压。原发性高血压与遗传、生活习惯、环境以及血管结构等各种复杂因素相关[2]。继发性高血压是由肾内分泌和心血管功能障碍等引发的[3]。据美国心脏病学会的指南，当收缩压大于140 mm Hg 及舒张压大于90 mm Hg 时，即高血压症状[4]。当血管长期承受过度的压力泵送血液时，就会导致冠心病、动脉硬化、外周动脉疾病、肾脏疾病和中风等高风险疾病[5]。

高血压患者主要通过服用降压药物 （包括ACE 抑制剂、利尿剂、β-受体阻滞剂、α-受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、肾上腺素能抑制阻断剂等）来进行治疗[6]，其中血管紧张素转换酶（Angiotensin converting enzyme，ACE） 是调节血压的主要因子，在调节哺乳动物的血压以及盐平衡和流体中起着重要作用[7]。ACE 抑制剂是治疗高血压的主要药物（包括卡托普利、福辛普利和赖诺普利3 大类）[8]。这些药物虽效果显著，但都伴随着严重的副作用[9]，如头痛、快速心率、头晕、咳嗽、味觉障碍和皮疹等不良症状[10]。从天然产物中开发ACE 抑制剂，成为当前的研究热点[11]。

海洋占地球表面积的7I%，是世界未来的食品基地，海洋产品更是人类摄取蛋白质的主要来源。据统计，海洋所提供食品的能力是陆地的1 000 倍[12]。海洋物种约占全球生物多样性总量的一半，由于海洋环境的特异性和多样性，导致海洋蛋白不论是一级序列还是其氨基酸组成均与陆地蛋白有所差异。总而言之海洋蛋白成为筛选新型ACE 抑制肽的重要蛋白来源[13]。

1 ACE 抑制肽作用机制

高血压病因十分复杂，目前普遍认为肾素-血管紧张素系统 （RAS） 和激肽释放酶-激肽系统（KKS）在调节血压方面发挥着重要作用[14]，在RAS和KKS 系统中，ACE 均起着至关重要的作用[15]。ACE 抑制肽通过抑制ACE 活性，从而影响ACE在RAS 和KKS 中的调节作用，调节过程如图1所示。在RAS 系统中，人体的肾小球旁器会分泌一种肾素水解酶进入血液中，将肝脏分泌的血管紧张素原分解成Ⅰ型血管紧张素[16]，ACE 通过将二肽（HL）从活性极低的Ⅰ型血管紧张素（NRVYIHPFHL）中释放出来，进而降解成活性很强的II 型血管紧张素 （NRVYIHPF），II 型血管紧张素是导致血压升高的主要物质之一，其通过使血管强烈收缩，促进醛固酮分泌，进而增加外周血管阻力，使Na+和水滞留，导致血压升高[17]。当ACE 抑制肽作用于ACE 时，ACE 无法使血管紧张素I 转化血管紧张素II，使得血压下降。在KKS 中，舒缓激肽原经激肽释放酶的水解作用，形成舒缓激肽RPPGFSPFR。ACE 催化舒缓激肽，导致其脱去C端的两个氨基酸残基而失去活性，造成血压升高。ACE 抑制肽能有效抑制ACE 的活性，从而阻断RSA 的升血压作用，同时有助于KKS 的降压作用，最终起到治疗高血压疾病的作用。

图1 ACE 抑制肽的降压机制Fig.1 Antihypertensive mechanism of ACE inhibitory peptides

2 ACE 活性抑制肽的结构与活性关系

ACE 抑制肽是酶抑制剂，其结构直接影响着抑制ACE 的能力。影响ACE 抑制肽活性的主要因素包括分子质量、肽链长度和氨基酸序列等[18]。大量研究表明，ACE 抑制肽通常为分子质量小的短肽。由于短肽容易与ACE 活性位点结合，且易吸收进入血液循环并保持其活性，因此2～12 个氨基酸短链肽的ACE 抑制肽活性更强[19]。涂丹等[20]利用碱性蛋白酶从罗非鱼鱼鳞中制备ACE 抑制肽，结果表明活性最高的ACE 抑制肽分子质量均分布于300～3 000 u 之间，其抑制率为88.26%。Zhao 等[21]以海参为原料，采用酶解法制备降血压肽，将酶解产物按分子质量分为＜10 ku、＜5 ku 和＜1 ku 3 种类型，其中分子质量＜1 ku 的ACE 抑制活性最高，IC50值为35 μmol/L。虽然大部分长链肽由于不能和ACE 的活性位点结合，没有ACE抑制活性，但晶体学研究表明，具有螯合锌原子酸性氨基酸【天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）】的长肽具有ACE 抑制活性，由此可见氨基酸序列组成也尤为重要[22]。研究表明酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和精氨酸的存在对ACE 抑制肽活性有显著影响[23]。贾俊强等[24]对270 种ACE 抑制肽组成进行统计分析，结果如表1所示，ACE 抑制肽的抑制活性主要在于N 端或C 端的氨基酸[25]。当活性肽的C 端是疏水氨基酸【如Glu、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）】时，抑制活性较强。当活性肽N 端是Phe、Tyr、Ala、色氨酸（Trp）、脯氨酸（Pro）和甘氨酸（Gly）时，有利于提高活性肽的ACE 抑制活性[26]。另外，大量被证实具有ACE 抑制活性的肽中至少含有一个Gly 残基或Pro 残基[27]。ACE 抑制肽的氨基酸的序列有如下特点：1） 二肽含有大量疏水侧链的氨基酸；2） 三肽结构中第1 残基处是芳香氨基酸，第2 残基处是正电荷氨基酸，第3 残基处是疏水氨基酸[28]；3）ACE 抑制四肽的序列的第1位是Tyr 和半胱氨酸 （Cys），第2 位是组氨酸（His）、Trp 和甲硫氨酸（Met），第3 位是异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、缬氨酸（Val）和Met，第4 位是Trp，且其抑制作用与C 端氨基酸有关[29]。

表1 降血压肽链两端氨基酸性质分析表[25]Table 1 Property analysis table of two terminal amino acids of antihypertensive peptides[25]

3 海洋ACE 来源

海洋蛋白源具有很高的生物价值，在人体中发挥各种保健功能，提高身体健康水平。海洋源降压肽首次在名为“bekasam”的发酵鱼中被发现[30]。此后，在鱼类、甲壳类、贝类和藻类中发现了各种降压肽。表2列出了部分海洋源降压肽的相关研究。

表2 海洋源降血压肽的研究Table 2 Study on antihypertensive peptides derived marine sources

3.1 鱼类

鱼类是高质量蛋白质的重要来源。目前，大多数研究是以鱼类蛋白质作为抗高压肽的来源。Yang 等[31]选用木瓜蛋白酶酶解军曹鱼，并采用超滤进行分离，制备出降血压肽，经动物实验表明，筛选出的降血压肽显著降低了原发性高血压大鼠的鼠的收缩压（SBP）。Taheri 等[32]以鲔为研究对象，采用胃蛋白酶水解，超分馏法分离，得到蛋白水解物FPH-I（<1 ku）、FPH-II（1～3 ku）、FPH-III（3～10 ku）和FPH-IV（>10 ku）4 种不同组分，其IC50值在0.45～1.86 mg/mL 之间，FPH-I （IC50为0.45 mg/mL）的活性较高。通过分析这4 种组分的氨基酸分布发现，FPH-I 组分中有大量的疏水氨基酸，可以作为氢供体并抑制ACE 活性。王晶晶等[33]以远东拟沙丁鱼肌肉为原料，通过双酶水解法（动物蛋白水解酶和风味蛋白酶）制备其酶解产物，通过超滤膜将其进行分离，运用色谱法对其进一步纯化，得到两种ACE 抑制肽，分别为Val-Glu-Pro-Leu-Pro（IC50为22.9 μmo/L）和Pro-Ala-Leu（IC50为12.2 μmo/L）。Wijesekara 等[34]以海龙鱼为原料，利用碱性蛋白酶制备粗肽，经多步分离纯化得到氨基酸序列为Thr-Phe-Pro-His-Gly-Pro和His-Trp-Thr-Thr-Arg 的两种多肽。

3.2 甲壳类

甲壳类降血压肽具有分子质量小、易吸收等特点[35]。Cao 等[36]使用胃蛋白酶来水解中国毛虾，制备出具有ACE 抑制活性的水解物，通过凝胶过滤法（Gel filtration chromatography，GFC）和反相高效液相色谱法（Reverse-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分离，得到抑制率为92.7%的肽序列（Leu-His-Pro）。Zhang 等[37]以中国毛虾为研究对象，经水解超滤制备出具有ACE 抑制活性的毛虾水解液，通过胃肠道消化模拟和动物实验表明，该水解液具有较强的降压作用。He 等[38]利用芽孢杆菌产生的蛋白酶对中国毛虾进行酶解，通过超滤、凝胶渗透层析和反相高效液相色谱分离纯化出3 种具有较高ACE 抑制活性的新型肽并对其序列进行鉴定，分别为Phe-Cys-Val-Leu-Arg-Pro、Ile-Phe-Val-Pro-Ala-Phe和Lys-Pro-Pro-Glu-Thr-Val。

3.3 贝类

海洋贝类以其高产量和高蛋白优势，成为降血压肽中的研究的热点[39]。Ou 等[40]以牡蛎为研究对象，利用酸性蛋白酶制备出ACE 抑制率为71.71%的酶解产物。Wu 等[41]利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解鲍鱼性腺，通过凝胶过滤柱层析和埃德曼降解法，分离鉴定出ACE 抑制肽Ala-Met-Asn，其分子质量小于1 ku，IC50值为106.24 μg/mL。Wang 等[42]对牡蛎中的降血压肽进行研究，经过优化，选取胃蛋白酶为酶解牡蛎蛋白的最佳蛋白酶，将酶解产物用Sephadex LH-20 凝胶过滤层析和RP-HPLC 进行进一步分离纯化，从而制备出一种新的降血压肽 （Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe），对其进行ACE 抑制活性检测，IC50值为66 μmol/L，并且该肽具有良好的热稳定性和pH 值稳定性。最后，将经胃蛋白酶处理制备的牡蛎水解蛋白以20 mg/kg 的剂量喂食原发性高血压大鼠（SHR），结果表明该肽具有降血压活性。

3.4 藻类

海洋中藻类植物的产量比小麦总产量多20倍，并且藻类植物中含有丰富的生物活性物质，其中降血压活性肽的研究相对较多[43]。Li 等[44]对海洋小球藻中的降压肽进行研究，结果发现蛋白酶N水解液具有最高的ACE 抑制活性，通过分离提纯得到Trp-Val、Val-Trp、Ile-Trp 和Leu-Trp 4 种降压肽；Barkia 等[45]采用木瓜蛋白酶对微藻的蛋白质提取物进行酶解，将水解液给原发性高血压大鼠口服5 d 后发现血压降低17 mm Hg。

3.5 其它海洋原料

根据以往文献发现，学者们不仅以常见的海洋生物为研究对象，进行了降血压肽的相关研究，也对肠腔动物、软体动物中的降血压肽进行了研究报道。Balti 等[46]以乌贼肌肉为研究对象，并对其进行酶解和层析，分离纯化出9 种ACE 抑制肽并分别用ESI-MS 和ESI-MS/MS 测定其分子质量和氨基酸序列，并通过动物实验证明其具有明显的降压活性。Ikeda 等[47]利用蛋白酶将冻干乌贼进行水解制备ACE 抑制肽，并采用Sephadex G-25 凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱进行分离纯化得到Glu-Lys-Ser-Tyr-Glu-Leu-Pro，Val-Glu-Leu-Tyr-Pro 和Ala-Phe-Val-Gly-Yyr-Val-Leu-Pro 3种肽，这3 种肽IC50值分别为18.02，5.22 μmol/L和14.41 μmol/L，结果表明这3 种肽具有较好的降压活性。

4 抗高血压肽的分离

生物活性肽是由氨基酸组成，肽键连接，具有特定的功能特性，对身体健康有益的特定蛋白质片段，例如抗氧化、抗菌、抗糖尿病和免疫调节等。从以往的文献中看，生产降血压肽的最常用的方法有酶解法、化学合成法和基因工程法3 种[51]。

4.1 酶解法

酶解法是目前获得降血压肽最常用的方法，通过选用合适的酶，在最优的反应条件下使ACE抑制肽活性片段得以释放。制备降血压肽常用的蛋白酶主要包括碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等[52]。不同的酶有不同的酶解条件，其中温度和pH 值是影响酶解的最主要因素[53]。表3中列出了制备海洋源降血压肽常用酶的最佳温度和pH 值。Li 等[54]利用胃蛋白酶水解鳕鱼骨架制备降血压肽，通过超滤膜获得ACE抑制率最高的组分，采用SP-Sephadex C-25 凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱对ACE 抑制肽进行进一步的纯化分离，最终制得IC50值为14.7 μmol/L 的降血压肽Phe-Gly-Ala-Ser-Thr-Ara-Gly-Ala。Wang 等[42]选用胃蛋白酶酶解牡蛎蛋白，并采用Sephadex LH-20 凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱对ACE 抑制肽进行分离，制备出具有序列Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe 的九肽，通过动物实验，证明其ACE 抑制活性的有效性。Liu 等[55]采用酶法从珍珠牡蛎肉蛋白中制备降血压抑制肽，采用超滤、聚乙二醇甲基醚改性的固定化金属离子亲和介质以及反相高效液相色谱对其水解产物进行分离纯化得到2 种新型的ACE抑制肽（His-Leu-His-Thr 和Gly-Trp-Ala）。结果表明，2 种肽均具有较高ACE 抑制活性值，IC50值分别为（458.1 ± 3.2）μmol/L 和（109.3 ± 1.5）μmol/L，可通过降低大鼠血压来证明其降压活性。酶解法的优点是成本较低，安全性能高，无毒副作用。

表3 不同蛋白酶制备ACE 抑制肽的最佳条件Table 3 Optimum condition for the preparation ACE using different enzymes

4.2 化学合成法

化学合成制备法分为液相合成法和固相合成法，该方法是将已知序列进行多肽合成，以提高制备效率。1963年，Merrifield[64]研究发明了固相合成法。与经典液相合成法相比，固相合成法的应用范围更广泛，该方法分离纯化更加简便、快捷且可自动化操作。陆东涛等[65]完成了海洋环肽stylissamide Ⅰ的全合成，以2-氯三苯甲基氯树脂（简称二氯树脂）为载体，选用6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯和N，N-二异丙基乙胺为缩合试剂依次连接9-笏甲氧羰基保护的氨基酸，在三氟乙醇的作用下将直链肽从树脂上切割下来，然后使用（3H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-3-氧基） 三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐，N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑和N-甲基吗啡啉在溶液中完成环合，最后在三氟乙酸的处理下脱去侧链保护基，获得环肽粗品。经反相高效液相色谱对所合成的环肽粗品进行纯化，终产物纯度98.9%。Kem 等[66]对海葵毒索的结构进行了全合成，首先对8 个关键结构片段进行合成，然后选择性引入双键对接，最终完成海葵毒素全分子的合成。固相合成多肽已成为合成多肽的主要方法，广泛应用于合成小肽。化学合成法多用于人工合成药物的制备，然而，其具有成本高、有毒副作用和化合物残留等缺点。

4.3 基因工程法

近些年，重组技术的迅速发展为降血压肽的开发利用开启了新篇章。该方法在已知ACE 抑制肽氨基酸序列的前提下，通过将目标肽克隆到载体上，进而构建重组基因工程菌，通过工程菌发酵制备ACE 抑制肽[67]。吴亚丽等[68]利用基因工程手段将高活性的降血压肽单体克隆到大肠杆菌融合表达载体DGEX-4T-2 之上，构建了重组降血压肽基因工程菌。通过细胞破碎和酶解制得融合蛋白GST-AHP，利用高效液相色谱对融合蛋白进行酶切，分离纯化得到较高活性的降血压肽段。基因工程法存在的主要问题是短肽容易被蛋白酶降解[69]，该方法适合制备长肽和蛋白质，然而，ACE抑制肽大部分为短肽，因此基因工程法制备降血压肽受到很大限制。

5 ACE 抑制肽的评价方法

随着人们对ACE 抑制肽的关注度与日俱增，建立方便可靠的ACE 抑制肽检测方法也日益迫切，目前的检测方法主要包括体外检测ACE 抑制活性和体内检测ACE 抑制活性两种方法。

体外检测ACE 抑制活性常用的主要有分光光度法和高效液相色谱法。分光光度法利用ACE水解底物，根据吸光度的变化来测定ACE 活性。N-[3-（2-呋喃基） 丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（FAPGG）和马脲酰组氨酰亮氨酸（HHL）是测定ACE 抑制肽的常用底物。有研究表明，FAPGG 和HHL 均可有效的测定ACE 抑制肽活性，然而，FAPGG 的稳定性要远远好于HHL，因此使用FAPGG 做底物不仅灵敏度高，还可以减少化学物质的消耗，节约试验成本[70]。尽管分光光度法非常有效，但该方法也存在着明显的不足，例如操作复杂、耗时且对痕量样品的分析有限。高效液相色谱法通过UV 监测器检测马尿酸的含量以确定ACE 活性。该方法虽操作简单，灵敏度高，但测样前需要大量的流动相和时间清洗柱子，以减少检测结果的误差，在检测过程中难以实现高通量。

体内测定ACE 抑制活性又称动物实验法，该试验通常以原发性高血压大白鼠为实验对象，将不同剂量的待检样品通过口服给药或静脉注射后测量大鼠血压的变化，通过记录摄入ACE 抑制肽前后收缩压的变化，判断ACE 抑制肽的活性。Jung 等[60]采用α-糜蛋白酶水解黄鳍鲽鱼骨架蛋白质制备了降血压多肽Met-lle-Phe-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Pro-Glu-Leu，其IC50值为28.7 μg/mL，将制备的多肽喂食原发性高血压大鼠，结果表明大鼠血压明显下降。Barkia 等[45]以海洋硅藻作为降血压肽的新来源，选用木瓜蛋白酶水解海洋硅藻，并持续5 d 将水解液喂食原发性高血压大鼠，结果表明400 mg/kg 剂量的水解液可以使原发性高血压大鼠血压降低约17 mm Hg。

6 结论

高血压是心血管疾病的主要病因，由于高血压没有明显症状，因此被称为“无声杀手”[71]。与降血压合成药物的严重副作用相比，海洋源降压肽更容易被人体吸收利用，且没有任何副作用。因此，海洋源ACE 抑制肽在世界范围内受到广泛的关注。然而，目前ACE 抑制肽临床应用较少，需要进一步研究其临床功效、在人体内的生物利用度和组织亲和力等。其次，ACE 抑制肽的分离纯化存在操作复杂，成本较高且难以实现工业化生产等方面的不足。在ACE 抑制肽的研发中着重弥补临床应用和工业化生产中的不足，将成为未来海洋源ACE 抑制肽的研究难点和重点。