热毒宁注射液速发型过敏反应机制研究

袁东琴，姜康，张宇，李冬，贺佳敏，范广俊，孙娜*（.大连医科大学附属第二医院药学部，辽宁 大连 602；2.大连医科大学药学院，辽宁 大连 6044；.复旦大学附属金山医院，上海 200540）

中药注射剂因起效快、生物利用度高，被广泛应用于临床治疗中，但是相关不良反应的报道也逐年增加。不良反应病例报告调查结果显示，中药注射剂引起的不良反应占中药引起的所有不良反应的40%以上[1]，过敏反应是其中占比较高的一项不良反应[2]。目前，中药注射剂的过敏反应已成为我国公众关注的主要问题之一，但是由于中药注射剂成分复杂，对于其引发的过敏反应的特点及其机制研究并没有形成统一的定论，因此，建立一种简单、可靠的方法来预测中药注射剂的过敏反应具有广泛应用前景。

热毒宁注射液是目前常用的一类清热解毒类中药注射液，由青蒿、金银花和栀子3味常用中药精制而成，具有清热、疏风、解毒的功效，临床主要用于治疗外感风热所致的感冒、咳嗽及急性支气管炎等[3]，目前已将热毒宁注射液加入到新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的诊疗方案中[4]。

随着热毒宁注射液临床应用范围的扩大，有关不良反应的研究报道也逐渐增多。热毒宁注射液最常见的不良反应是过敏反应，临床表现主要为皮肤瘙痒和斑丘疹等，大多数不良反应发生在用药后30 min内[5-6]；且血清免疫毒理学研究表明，热毒宁注射液过敏反应可能是由免疫球蛋白E（IgE）介导的Ⅰ型过敏反应[7]，但也有研究显示临床使用剂量下，热毒宁注射液及其主要成分绿原酸单次给药不会诱导大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞（RBL-2H3）释放组胺[8]。因研究方法和手段的单一性导致热毒宁注射液过敏反应的研究并没有形成统一的定论，因此本研究以RBL-2H3作为评价模型，探讨热毒宁注射液对RBL-2H3的影响及其可能的致敏机制，为进一步的基础研究及临床安全用药提供参考。

1 材料

1.1 细胞和试药

RBL-2H3（武汉普诺赛生命科技有限公司）。热毒宁注射液（批号：200714，江苏康缘药业股份有限公司），钙离子载体A23187（批号：128M4161M）、β-氨基己糖苷酶（β-hex）底物溶液（批号：SLBR7548V）（美国Sigma公司），0.33%中性红染料（批号：201904216，北京索莱宝科技有限公司），MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（批号：SC122-01，北京赛文创新科技有限公司），大鼠白介素4（IL-4）ELISA试剂盒（批号：E-ELR0014c，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司），Fluo-3 AM Ca2＋荧光探针（批号：S1056，上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 仪器

CO2培养箱MCO-20AIC（日本Sanyo公司），多功能酶标仪SpectraMax190（美国Molecular Devices公司），倒置显微镜DMI1（中国Leica公司），倒置荧光显微镜Leica DMI8（德国徕卡公司）。

2 方法

2.1 细胞培养及分组

RBL-2H3采用含10%胎牛血清、1%青-链霉素双抗的DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养，传代比例为1∶3，每2～3日传代一次。实验分组为：对照组（正常细胞未加药处理），热毒宁注射液（25、50、100、200 μL·mL－1）处理组，阳性对照组（钙离子载体A23187，1μmol·L－1）。

2.2 细胞脱颗粒

2.2.1β-hex释放率的测定 取对数期的RBL-2H3，以1×105/孔接种于24孔板孵育过夜，弃上清液，用Tyrode’s buffer溶液洗涤细胞两次，在室温下加入Tyrode’s buffer溶液、不同浓度的热毒宁注射液和1% Triton X-100、钙离子载体A23187孵育1 h，冰浴10 min终止反应，取50 μL上清液于96孔板中，同时加入50 μL的β-hex底物溶液孵育1 h，加入Na2CO3/NaHCO3缓冲液，5 min内于酶标仪上405 nm处检测各组OD值。

2.2.2 中性红染色 取“2.2.1”项下24孔板，用Tyrode’s buffer溶液洗涤细胞两次，加入中性红染色（0.33%）孵育5 min，弃上清液，倒置显微镜下观察脱颗粒的RBL-2H3并拍照。

2.3 细胞活力测定

取对数期的RBL-2H3，以1×104/孔接种于96孔板孵育过夜，每孔加入不同浓度的热毒宁注射液孵育1 h，每孔加入20 μL MTT工作液，孵育4 h，弃上清液，加入100 μL DMSO孵育15 min，待结晶全部溶解时于酶标仪上570 nm处检测各组OD值。

2.4 ELISA法检测 IL-4的释放量

取对数期的RBL-2H3，以1×106/孔接种于6孔板，孵育过夜，每孔加入Tyrode’s buffer溶液、不同浓度的热毒宁注射液和钙离子载体A23187孵育1 h。使用ELISA试剂盒检测上清液中IL-4的含量。

2.5 细胞内Ca2＋浓度测定

取对数期的RBL-2H3，以5×104/孔接种于24孔板，孵育过夜，用PBS洗涤细胞两次，加入3.5 mmol·L－1Fluo-3 AM Ca2＋孵育30 min，用PBS清洗两次，加入1 mL PBS孵育20 min，热毒宁注射液在初始成像后10 s加入到孔中，在倒置荧光显微镜下拍摄不同时间（0、30、50、70、90 s）的荧光图片。

2.6 统计分析

所有计量资料均以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 20.0统计学软件，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义；其中Ca2＋相对荧光强度曲线运用Image J软件分析90 s内的细胞荧光图片，以F/F0为纵坐标，绘制相对荧光强度变化曲线图。

3 结果

3.1 热毒宁注射液引起RBL-2H3脱颗粒

3.1.1 热毒宁注射液对β-hex释放的影响 如图1所示，与对照组相比，随着热毒宁注射液浓度的增加，β-hex的释放率显著增加，且呈剂量依赖性，其中热毒宁注射液浓度在100、200 μL·mL－1时，β-hex的释放率分别为（17.39±2.464）%，（26.39±4.391）%（P＜0.01）。由此可见，热毒宁注射液可剂量依赖性地引起β-hex的释放率增加。

图1 热毒宁注射液对β-hex释放率的影响Fig 1 Effect of Reduning injection on the releasing rate of β-hex

3.1.2 RBL-2H3脱颗粒后的细胞形态变化 如图2所示，用中性红染液对处理之后的细胞进行染色，从倒置显微镜中可以观察到，正常的RBL-2H3呈梭形，细胞膜完整（见图2A）；而用热毒宁注射液处理的细胞出现脱颗粒现象（见图2B），细胞体积变大，细胞膜破裂，细胞内有空泡产生；图2C 为1% Triton X-100裂解的细胞，细胞已无清晰形态，细胞内颗粒变少，而细胞外可看到一些被染色的颗粒。

图2 RBL-2H3脱颗粒后的细胞形态变化（×10）Fig 2 Morphological change of RBL-2H3 after degranulation（×10）

3.2 热毒宁注射液对细胞活力的影响

采用MTT法检测热毒宁注射液对RBL-2H3活力的影响，结果如图3所示，热毒宁注射液在25、50、100、200 μL·mL－1时，对细胞的活性无明显影响。

图3 热毒宁注射液对细胞活力的影响Fig 3 Effect of Reduning injection on cell viability

3.3 热毒宁注射液对IL-4释放的影响

如图4所示，随着热毒宁注射液浓度的增加，IL-4的释放浓度与对照组相比显著增加，且呈剂量依赖性，其中热毒宁注射液浓度在50、100、200 μL·mL－1时，IL-4的释放浓度分别为（8.009±1.1）pg·mL－1、（12.62±0.88）pg·mL－1、（15.13±1.1）pg·mL－1，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。

图4 热毒宁注射液对IL-4释放的影响Fig 4 Effect of Reduning injection on IL-4 release

3.4 热毒宁注射液对细胞内Ca2＋的影响

从图5中，可以明显观察到，RBL-2H3在不同浓度的热毒宁注射液作用下，细胞内荧光强度发生明显改变，在热毒宁注射液作用细胞30 s时，Ca2＋荧光强度明显增强，而随着作用时间的推移，Ca2＋荧光强度呈现降低的趋势。

图5 热毒宁注射液对RBL-2H3荧光强度的影响（×10）Fig 5 Effect of Reduning injection on the fluorescence intensity of RBL-2H3（×10）

运用Image J软件分析90 s内记录的各细胞荧光图片的荧光强度，以F/F0为纵坐标，绘制RBL-2H3在热毒宁注射液作用下细胞的相对荧光强度变化曲线。如图6所示，细胞在作用30 s内有一定荧光强度增加的趋势，随着作用时间的推移，细胞的荧光强度开始逐渐降低，表明胞内 Ca2＋浓度在升高之后逐渐降低。

图6 RBL-2H3相对荧光强度变化曲线Fig 6 Change curve of relative fluorescence intensity of RBL-2H3

4 讨论

中药注射剂诱发的过敏反应已引起广泛关注，虽然目前已有大量研究探索中药注射剂过敏反应的特点及其致敏机制，如有关双黄连注射液[9-10]、清开灵注射液[11]的研究，但是由于中药注射剂成分以及制备工艺等的复杂性，对于其引发的过敏反应的特点及其机制研究并没有形成统一的定论，目前通过检测相关炎性介质的含量变化，并深入探究其致敏机制已成为研究的趋势。

自从1981年以来，RBL-2H3已被广泛用作肥大细胞模型，RBL-2H3易培养且对FcεRI介导的机制具有特异性反应等特点[12]，近些年兴起的检测药物致敏性的体外模型[13]，为了探究热毒宁注射液引起的速发型过敏反应的特点及其机制，本研究选用RBL-2H3作为细胞模型，研究发现在用不同浓度的热毒宁注射液与RBL-2H3孵育30 min，通过中性红染色可明显看出细胞出现脱颗粒现象。脱颗粒是肥大细胞发生过敏反应时的重要现象，细胞脱颗粒之后，由中性红染色法或者甲苯胺蓝染色法可以明显看出细胞有空泡形成，由此可见，热毒宁注射液引起RBL-2H3脱颗粒，推断热毒宁注射液可能会引起速发型过敏反应。

同时选用过敏反应的重要标志物β-hex、IL-4作为释放介质的检测指标[14]，对热毒宁注射液引发的速发型过敏反应进行综合评价。研究发现随着热毒宁注射液浓度的升高，β-hex以及IL-4的释放率明显增加，且呈剂量依赖性。研究表明热毒宁注射液可引起RBL-2H3的脱颗粒，但是如果实验所设置的药物浓度对细胞有毒性作用，影响细胞的活力，同样会使细胞出现脱颗粒现象，为排除此影响因素，选用MTT法探究所设置浓度下热毒宁注射液对细胞活力的影响，研究表明在热毒宁注射液所设置浓度下对细胞活力并没有影响，进一步证实热毒宁注射液可引起RBL-2H3的脱颗粒，引发速发型过敏反应。

钙运动与肥大细胞脱颗粒的机制密切相关，当肥大细胞被激活时，细胞间Ca2＋浓度增加，释放细胞质颗粒中包含的炎症介质，引起肥大细胞脱颗粒[15]。本研究用Fluo-3 AM Ca2＋荧光探针探究热毒宁注射液作用于RBL-2H3时，细胞内Ca2＋浓度变化，结果细胞均在作用30 s内有一定荧光强度增加的趋势，随着作用时间的推移，细胞的荧光强度开始逐渐降低，表明胞内钙离子浓度在致敏90 s内逐渐升高之后逐渐降低，提示热毒宁注射液可能通过调节Ca2＋内流而引起RBL-2H3的脱颗粒。

综上所述，热毒宁注射液可剂量依赖性地引起RBL-2H3脱颗粒，其机制可能是通过调节细胞内Ca2＋浓度而发挥作用，本研究进一步证实了热毒宁注射液过敏反应患者的血清免疫毒理学研究结果，为探究热毒宁注射液诱发的速发型过敏反应提供一定的实验依据，其具体的作用机制，需要进一步深入研究。