抗稻瘟病基因Pigm组合标记的开发及应用

李白 蔡之军 王蕾 陈婕 曹奎荣 李军 种高军

（1.嘉兴市农业科学研究院，嘉兴 314016；2.嘉兴职业技术学院，嘉兴 314036）

稻瘟病是水稻三大病害之一，化学防治是其最直接、有效的防治措施，但易产生耐药性和生态问题［1］。培育和种植抗性品种是目前防治稻瘟病最经济、有效的手段［2-3］。传统育种主要是通过表型抗性鉴定，筛选抗病品种，但整体工作量大，育种周期长，且易受环境条件限制。分子标记辅助选择（mark-assisted selection，MAS）对内部目标基因或与目标基因紧密连锁的位点进行选择，不受外部环境影响，是传统育种有效辅助手段［4］。

选育抗稻瘟病品种的关键策略，是聚合抗谱广且持久的抗病基因［3，5］。Pigm 是从谷梅 4号（Gumei4）中鉴定到的抗稻瘟病基因，与Pi2、Pi9、Pi40、Pi50和Piz-t同属6号染色体Piz位点，但较它们抗谱更广，对叶瘟和穗瘟都有较好抗性，是目前常用的抗稻瘟病基因之一［3，6-13］。Wu 等［14］系统地评估了Piz位点不同等位基因与其他广谱R基因（如Pi1、Pi33和Pi54）结合的抗性效应，结果表明，Pigm与Pi1、Pi54或Pi33是最有效的基因组合模式。

用于检测Pigm的标记包括M80410［6］、Pigm-4［15］、T9E4［16］、DG-2［17］、R060939［18］、GMR-3［19］和T-Pigm［20］等，经分析，这些分子标记或特异性不足或不能鉴定杂合基因型。本研究通过对这7个Pigm分子标记的分析与实验，筛选了Pigm-4与M80410组合标记。利用组合标记辅助选育镇糯19×空育131（Pigm）杂交后代，选育了糯稻品系NK29，具有较好稻瘟病抗性。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验用的水稻材料主要为嘉兴市农科院留存，其中空育131（Pigm）由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供，镇糯19引种于江苏省镇江市农科院。

1.2 方法

1.2.1 分子标记序列分析 在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov网 站 上 对 7个 Pigm 标 记 Pigm-4、T9E4、DG-2、M80410、R060939、GMR-3 和 T-Pigm 进行分析，碱基序列见表1，其中T-Pigm是扩增受阻PCR体系，包含2对引物，结果见表2。

表1 用于检测Pigm基因的分子标记Table 1 Molecular markers used to detect Pigm

1.2.2 PCR检测分析 分别用7种标记对40份水稻材料（表3）进行检测。采用TPS法提取水稻叶片基因组DNA，PCR检测采用20 μL体系，含10 μL 2×PCR Mix，正、反向引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL（约25 ng），超纯水补至20 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 kb/min，35个循环；72℃延伸5 min结束。使用2%琼脂糖凝胶电泳。Pigm-4与M80410组合标记多重PCR，引物各0.5 μL，其他反应条件与上述相同。

1.2.3 辅助选育糯稻品系NK29 以镇糯19为母本，空育131（Pigm）为父本进行杂交，F1代与镇糯19进行回交，之后连续自交至获稳定品系NK29，期间利用Pigm标记辅助选择，并进行稻瘟病抗性鉴定（苗期喷雾接种）。

2 结果

2.1 标记比对分析

7个Pigm分子标记比对分析表明，M80410区段序列仅在Gumei4中有扩增片段，特异性强，但不能区分杂合基因型；Pigm-4、T9E4、R060939和T-Pigm标记能鉴定杂合基因型，但在其它非Pigm序列中也有扩增片段，特异性不足；DG-2、GMR-3特异性不足，也不能区分杂合基因型，比对结果见表2。Gumei4 Pigm序列（NCBI登记号：KU904633.2）长度为178 704 bp， 标 记 Pigm-4、T9E4、DG-2、M80410、GMR-3、T-Pigm扩增片段均在Pigm内部，根据Gumei4和Nipponbare分子标记的相对位置，估计R060939的位置为-897 333- -896 515，相对遗传距离见图1。

图1 Pigm标记相对遗传距离Fig.1 Relative genetic distances of Pigm markers

表2 Pigm标记引物NCBI比对分析Table 2 Alignment and analysis of Pigm marker primers by NCBI

2.2 PCR检测分析

用7个Pigm分子标记对40份水稻品种品种进行检测，见表3，其中Gumei4 7个标记均为阳性。根据结果推断，标记中M80410、Pigm-4和T-Pigm特异性好，仅Gumei4是阳性，结合引物比对结果，M80410特异性最好，Pigm-4和T-Pigm对Pigm检测可能会受Pi50（KP985759.1）干扰；GMR-3、T9E4和DG-2检测特异性稍差；T9E4和DG-2两个标记的检测结果相似度较高，40个品种中除日本晴，其他39个结果一致。这些标记中R060939虽与Pigm连锁，但检测特异性不明显。

表3 水稻样品Pigm标记检测Table 3 Detection of Pigm markers in rice varieties

2.3 组合标记检测

M80410特异性强，但是显性标记，不能区分杂合基因型，降低了MAS育种的准确性与速度。而Pigm-4能区分杂合基因型，特异性也较好，带型与M80410相差400 bp左右，见图2。可结合两个标记特点，利用多重PCR建立组合标记检测体系，M80410与Pigm-4组合标记的带形图和结果判定见图3。将组合标记应用于镇糯19×空育131（Pigm）的MAS育种，见图4，结果说明组合标记能特异性检测Pigm基因，并能区分杂合型基因。

图2 M80410、Pigm-4扩增条带类型Fig.2 Types of M80410 and Pigm-4 amplified bands

图3 M80410和Pigm-4组合标记扩增条带结果Fig.3 Amplification results of M80410 and Pigm-4 combined marker

2.4 组合标记辅助选育糯稻品系NK29

水稻品系NK29及主要中间材料经组合标记检测，能区别Pigm “+”、“-”和“±”3种基因型，提高辅助育种效率，见图4。Pigm导入后高世代材料的稻瘟病抗性见表4。NK29经安徽省农科院植微所鉴定，两年稻瘟病病情综合指数均在1.8-2.7级，表现为“抗”或“中抗”，较镇糯19的稻瘟病抗性具有显著的改良。

表4 Pigm导入系高世代稻瘟病抗性鉴定Table 4 Identification of blast resistance of Pigm introgression line in high generation

图4 M80410与Pigm-4组合标记检测结果Fig.4 Detection results of M80410 and Pigm-4 combined marker

3 讨论

稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的，水稻与病菌的相互变异、进化、作用像是一项持久的“军事装备战”［21］，其中Pigm正扮演着重要角色。Deng 等［22］对 Pigm 的研究表明，Pigm是一个包含 13 个元件的基因簇，这可能是其较 Piz基因座其他等位基因抗谱更广的原因，进一步研究表明 Pigm 表观遗传主要受 PigmR（R6）与 PigmS（R8）共同作用，这维持了水稻抗性与产量的平衡，可能是它抗性持久的原因之一。抗稻瘟病基因具有类似NBS结构，这导致了这类基因有部分相似或相同序列区段。通过比对发现标记Pigm-4 标记所在区段序列与同属一个基因座的Pi2、Pi9、Pi40、Piz-t、Piz、均不同［16］，表现出Pigm序列的特异性，但与Pi50、Pid4所在区段序列相似，其特异性较M80410稍差，在MAS工作中，也存在一些样品Pigm-4检测为“+”，M80410检测为“-”。M80410特异性强，但它是显性标记，不能区分纯合与杂合基因型，这不利于分子辅助育种中对纯合体的筛选及杂合体的鉴别。Pigm-4 扩增条带大小约 81 bp（+）、125 bp（-）和 155 bp（-），M80410扩增条带约 517 bp（+），4种条带差异明显，故本研究将Pigm-4与M80410组合标记在一起，利用多重PCR和琼脂糖凝胶电泳检测Pigm基因型。组合标记的多重PCR条件与单个标记相同，扩增效果较好，未经优化也可用于检测。但检测体系也存在不足，如PCR的引物浓度配比、体积缩减、最优Tm和延伸时间筛选等可做进一步优化，以更好地应对大批量样品的Pigm标记检测。同时更好的Pigm检测方法或可进一步开发。

近年来育种家们已利用Pigm育成多个优良品种或品系，如空育131、龙粳26、垦鉴稻6、农香42、R9311（Pigm）、KT27S 和 JF35-2 等［23-28］。 本研究以镇糯19为母本，空育131（Pigm）为父本，利用M80410与Pigm-4组合标记，遴选了一批含Pigm的高世代材料。结果表明F1、BC1F1和BC2F6株系均比母本镇糯19提高了稻瘟病抗性，最终结合农艺性状选育了携带Pigm的糯稻品系NK29。NK29较镇糯19的稻瘟病抗性具有显著改良，且保留了镇糯19较好糯性的特性，目前已进入区试续试阶段，但要准确评价 Pigm 在糯稻育种中的利用价值，还需要进一步研究。

4 结论

M80410标记特异性强，Pigm-4标记能区分杂合基因型，将Pigm-4与M80410作为组合标记，能快速准确地鉴定Pigm 的纯合显性、纯合隐性和杂合基因型。组合标记用于MAS，选育了糯稻品系NK29，具有较好稻瘟病抗性。