高粱双粒突变体Dgs的遗传分析与基因定位

周诗晨 仪治本 王馨翊 杨晓颖 孙丽娜 栾维江 梁闪闪

（1.天津师范大学生命科学学院 天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津300387；2.中北大学化学工程与技术学院，太原 030051）

高粱［Sorghum bicolor（L.）Moench］是世界第五大谷类作物，包括谷物高粱、饲用高粱和生物质/甜高粱等，用途广泛。与其他作物相比，高粱具有更高的抗逆性，能适应干旱、盐碱化和高温。此外，由于高粱基因组相对较小（约800 Mb），且已完成测序，使它成为玉米、甘蔗等基因组复杂的C4生物的遗传模型［1］。穗粒数是高粱等禾本科作物最重要的产量构成因素之一，高粱花器官发育不仅是植株形态建成的重要事件，也可能直接影响穗粒数，进而影响作物产量［2］。因此，鉴定和克隆高粱花器官发育新基因对培育高产优质的高粱品种具有重要意义。

目前，在拟南芥和水稻等禾本科植物中已鉴定和克隆了多个与花器官发育相关的基因，如水稻花器官突变体 fon1（floral organ number 1）、fon2、fon3、fon4、fon5、fon6均表现出多花器官或多籽粒性状，除FON5与FON6，其他基因均已被克隆，并在调控和维持水稻的花分生组织中起重要作用［3-10］。高粱多粒突变体国内外研究较少，研究结果尚不统一。早在1916年，Cron［11］在一个杂交种中发现了几个三粒种子和大量双粒种子小穗，将三粒小穗的种子种植以后，发现这种异常得到遗传，并且三粒小穗的种子除了稍扁平外，与正常单粒小穗的种子没有差别；1936年，Karper等［12］发现几个高粱突变体植株，主要表现为小花内没有花药，在中心子房周围有1-6个数目不等的次级子房，次级子房数3个居多，它们通常有1个或2个柱头，极少数情况下有3个柱头，产生的种子数目和大小受子房数、营养、环境等因素影响，且为隐性遗传；1935年，在feterita×Sudan杂交的F3代植株中发现有些植株有梗小穗正常发育并结实，只是种子略小于无梗小穗的种子。Jiao等［13］报道由EMS诱导产生的突变体msd1，其有梗小穗和无梗小穗都可以产生正常的种子，经鉴定，该突变体是由MSD1的碱基突变，导致氨基酸发生改变，且突变性状为隐性遗传。对其机制进行探究表明，MSD1编码TCP转录因子，通过激活JA的生物合成和信号转导来抑制有梗小穗的发育［14］；Casady等［15］对高粱双粒性状进行报道，表明双粒是显性性状，但是基因型和环境均显著影响双粒形成的比率；梁小红等［16］对高粱TW960双粒结实特性进行遗传分析，表明TW960双粒特性是单基因控制的显性遗传，受环境影响较小。复粒高粱材料SZ0和10个国内外高粱双粒品种分别与普通单粒品种杂交，遗传分析发现不同的品种的双粒基因显隐性不同，且不同的品种复粒率的差距较大［17］。

迄今为止，国内外对双粒高粱的研究大部分集中在遗传分析，而在双粒高粱基因定位和克隆方面的研究相对较少。天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室前期在田间发现1个双粒高粱突变体（double-grain，Dgs），该突变体花器官数目异常、结双籽粒。

本研究利用Dgs双粒突变体材料与单粒高粱品种晋粱5号组配杂交组合，获得F2分离群体，对目标性状进行遗传分析，并采用BSA-seq测序与图位克隆相结合的方法对控制高粱双粒的目的基因进行定位，为进一步分离克隆目的基因以及研究其分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

高粱双粒突变体Dgs是田间自然突变体，经过连续多代套袋自交种植，确定突变性状能稳定遗传。野生型材料是晋粱5号。用晋粱5号与高粱双粒突变体Dgs组配杂交组合，获得F1植株，将F1种子种植得到F2群体。2个亲本和F2群体共同种植于天津师范大学试验田用于遗传分析和基因定位。试验田进行常规的田间管理。

1.2 方法

1.2.1 突变体表型观察 在高粱的开花期，从突变体材料和野生型材料中随机选取小花在体视显微镜下进行观察，主要观察其雄蕊数目和雌蕊数目以及形态变化。籽粒灌浆后期，分别观察两亲本材料的每个小花上的籽粒数目及形态变化。

1.2.2 遗传分析 种植杂交种，获得F1植株，田间观测植株的花器官及籽粒的表型。种植F1种子获得F2分离群体，在种植F1和F2时，同时种植双粒突变体和野生型晋粱5号。对F2群体中双粒表型植株和单粒表型植株的数目进行统计，计算二者分离比，利用卡方测验，检验其分离比是否符合孟德尔遗传规律。并根据分离情况，分析该基因的遗传特征。

1.2.3 BSA-seq分析 利用混合群体分离分析法（bulked segregant analysis，BSA）进行基因初步定位，在F2群体双粒型单株和野生型（单粒）单株分别选取60株，采用CTAB法提取DNA，等量混合所选单株的DNA，构建单粒表型和双粒表型的DNA混池（S池和D池），和2个亲本一起送至百迈客生物科技公司，利用Illumina HiSeq PE150平台进行全基因组重测序，测序平均深度为30×。测序后的数据通过BWA 0.7.10软件的mem方法［18］比对到高粱的参考基因组［19］；比对结果利用软件 SAMtools 0.1.19［20］去除重复数据（参数为rmdup），并进行SNP检测；利用BCFtools软件对检到的SNP数据进行过滤，亲本中的SNP过滤标准是Q＜10，DP＜5，多等位，或者杂合型。最后筛选出在双粒突变体和晋粱5号2个亲本间有多态的SNP，利用QTLseqr［21］R数据包进行基因的定位分析。使用滑动窗口策略来绘制2个混池的SNP-index图（以1 Mb为窗口，100 kb为步长）。得到2个混池的SNP-index图后，计算分离位点在2个极端池中基因频率的差值（△SNP-index），并过滤掉＜0.1的位点，然后计算每个SNP的G'值，并采取滑动窗口的策略绘图，滑动窗口以1 Mb的窗口大小和100 kb的步长绘制平均G'值。

1.2.4 目的基因的连锁分析 在初步定位的候选区间内，根据两亲本的重测序结果和已公布的高粱参考基因组序列，设计Indel和SSR分子标记，利用 NCBI的 Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?link_loc=blasthome）进行引物设计。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，然后对F2代隐性单株个体进行连锁分析，进一步缩小定位区段。PCR扩增体系：模板DNA 1 μL、10×buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL、5 μmol/L 引物各 1 μL、5 U/μL DNA 聚合酶 0.2 μL，以ddH2O 补足至 20 μL。反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s；55-60℃ 30 s（依据引物的不同退火温度进行调整）；72℃ 30 s（不同长度的产物延伸时间不同，按照1 kb/min进行调整）；35个循环；72℃ 7 min，4℃保存。DNA Taq酶采购自大连TaKaRa公司，扩增产物用1%-4%的琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色后于紫外下观察拍照并进行条带分析。

2 结果

2.1 双粒突变体的表型特征

正常情况下，野生型晋粱5号的小花有3个雄蕊、1个子房以及1对羽状柱头，相应的，1对颖壳内只结一粒种子。与野生型相比，突变体Dgs的小花有4-7个雄蕊，2个子房，每个子房上各有1对羽状柱头，这两个子房均可育，结实后形成一壳两粒的表型，同一颖壳的2个籽粒的形态大小并无显著差异，而且均具有发芽能力（图1）。突变体Dgs的小花偶尔出现4个或5个雄蕊，2个雌蕊；或者6个或7个雄蕊，3个雌蕊，形成一壳三籽粒。此类一壳多籽粒的植株所占比例不足1‰。

图1 野生型晋粱5号和突变体Dgs小花及籽粒的表型Fig.1 Phenotype of the floret and grain of wild-type S.bicolor Jin 5 and mutant Dgs

2.2 遗传分析

将野生型晋粱5号与双粒突变体Dgs杂交，F1代植株所结的籽粒均表现为双粒性状，表明该突变性状表现显性遗传。F2代群体植株的小花出现1个雌蕊3个雄蕊和2个雌蕊6个雄蕊，相应植株所结的籽粒，出现一壳单粒和一壳双粒2种表型，表现出明显的分离，双粒表型植株313个，单粒表型植株117个，经卡方检验发现（表1），表型符合3∶1分离比例，表明该突变体性状受1对显性基因控制。

表1 晋粱5号×Dgs F2群体表型统计分析Table 1 Statistical analysis of phenotype of F2 population from S.bicolor Jin 5×Dgs

2.3 Dgs定位

2.3.1 亲本及F2群体单双粒单株BSA混池测序 测序共获得约383.21 M初始测序reads数，为保证信息分析质量，对初始测序reads进行过滤，得到Clean reads，用于后续信息分析。数据过滤的主要步骤如下 ：（1）去除带接头（adapter）的 reads；（2）过滤N含量超过10%的reads；（3）去除质量值低于10的碱基超过50%的reads。最后获得过滤后的碱基数为114.73 Gb，Q30平均达到93.36%。平均每个亲本产生数据量为11 Gb Clean data，每个混池产生数据量为44 Gb Clean data，保证Q30达到80%。GC含量在43.25%-43.86%（表2）。综上所述，亲本和2个混池样本的数据量足够，测序质量合格，GC含量分布正常，建库测序成功。

表2 测序数据质量情况Table 2 Statistics from the qualities of the sequencing

2.3.2 BSA-seq分析 对上述获得的过滤后测序数据与已发布的高粱基因组数据进行比对组装，参考基因组大小为 655.2 Mb（V3）［19］。然后进行 SNP calling和筛选，最后筛选出在双亲之间有多态性的有效SNP位点共3 894 375个。利用这些多态性SNP进行突变基因定位（BSA-seq）。利用QTLseqr R数据包计算各个SNP位点的△SNP-index，同时计算G'值，并采取滑动窗口的策略绘图。可以明显检测到位于高粱的第6染色体末端有一个峰值（图2），物理区间约为10.01 Mb，表明该突变性状与高粱第6染色体上这个区段的SNP标记具有明显的连锁效应。

2.3.3 隐性个体验证候选区段内的连锁标记分析 为了验证BSA-seq定位结果的准确性，根据两亲本间序列差异，在候选关联区间及其邻近位置的变异位点处设计了15对Indel分子标记，并对2个亲本进行多态性筛选，发现标记Indel2930和Indel6958显示多态性，引物信息见表3。然后用这两个标记对F2代群体中的纯合隐性单粒单株进行分析，发现这两个分子标记明显与目标性状表现连锁（图3），117个隐性单株在Indel2930和Indel6958标记处分别有9个和10个重组个体，因此，将Dgs定位于Indel2930和Indel6958之间，物理距离为680 kb。为了进一步缩小定位区段，又在该区段内设计了9对Indel引物和26对SSR引物，其中有5对引物在双亲之间有多态性，引物信息见表3。用这些标记对隐性纯合单粒单株进行连锁分析，最终将突变基因定位在Indel2930和SSR7060之间，物理距离为404 kb（图4）。

图4 Dgs的遗传连锁图谱Fig.4 Genetic linkage map of the Dgs gene

表3 Dgs连锁分析的主要引物信息Table 3 Information of primers used for linkage analysis of Dgs

图3 部分F2代隐性单株的PCR产物凝胶电泳图Fig.3 PCR agarose gel electrophoresis of partial F2 recessive individuals

3 讨论

小穗是禾本科植物各种类型花序结构的构成单位。高粱小穗根据其与花序分枝的连接方式分为2种类型：无梗小穗（sessile spikelet，SS）直接连接到花序分支上，而有梗小穗（pedicellate spikelet，PS）通过称为花梗的短叶柄连接到花序分支上［2］。一般情况下，只有SS能产生可育的花和籽粒，SS上着生的小花内有3个雄蕊和1个雌蕊，所产生的籽粒也是一壳一粒；而PS能产生雄花器官或根本没有花器官。本研究发现一个突变体Dgs，其无柄小穗上的小花中有2个雌蕊，6枚雄蕊，最终导致了一壳双籽粒的性状。之前报道的研究较为深入的高粱有柄小穗突变导致多籽粒性状的突变体msd1，其有柄小穗（PS）能正常发育，产生有活力的种子［14］。本研究所发现的双籽粒突变体与msd1突变体属于不同的突变类型。

本研究利用单粒和双粒突变体杂交产生的F2分离群体进行遗传分析及BSA-seq基因定位最终将该突变基因定位于高粱第6染色体404 kb区段内。此前有报道高粱一壳双粒突变性状，认为双粒是显性遗传性状，但是双粒形成的比率容易受到基因型和环境影响［15］。高粱TW960双粒特性是单基因控制的显性遗传，受环境影响较小［16］。复粒高粱材料SZ0以及10个国内外高粱双粒品种的双粒基因有显性也有隐性，且不同的品种复粒率的差距较大［17］。这些有关双粒突变体研究仅限于遗传分析，没有高粱双粒基因的定位和克隆的报道。本文所定位的Dgs，是高粱中第一个定位的无柄小穗双粒突变性状基因。

拟南芥和水稻多籽粒性状已有一定研究，也已克隆了相关基因。在拟南芥中，CLV1编码一个富含亮氨酸重复的类受体蛋白激酶，CLV2编码一个类似的蛋白，它有一个亮氨酸重复（leucine rich repeat，LRR）结构域，但缺乏细胞质激酶结构域，这两种蛋白质被认为形成异源二聚体，LRR结构域似乎在配体结合中起作用。CLV3编码一个包含CLE结构域的小分泌蛋白，并作为CLV1-CLV2信号转导复合体的假定配体。CLV发生突变，不能抑制WUSCHEL（WUS）的活性，分生组织干细胞状态不能正常维持，导致顶端分生组织、花序分生组织以及花分生组织的增大，最终造成花器官数目增加，花器官形态发生变化［22］。水稻中发现一系列的花器官突变体fon1、fon2、fon3、fon4、fon5、fon6、fon（t）等都表现出多雌蕊现象［23］。FON2和FON4与拟南芥CLV3同源，在维持水稻的花分生组织中起重要作用［5-6］。FON1与拟南芥CLV1同源。基因FON1、FON5、FON6突变造成花分生组织增大，进而使花器官数目改变，但是营养分生组织和花序分生组织未见明显差异。而FON3除了影响花器官数目，还参与穗部发育调控［7］。水稻花器官突变基因大多都与拟南芥CLV基因同源，表明CLV调控分生组织大小的途径在双子叶植物和单子叶植物中具有功能上的保守性。此外，MADS-box类基因也和花器官发育相关，如拟南芥中的AP1、AP3、PI和AG，以及水稻的OsMADS16等［24-27］。本研究中Dgs定位区段内的53个基因在数据库Phytozome进行基因功能注释分析，发现有一个基因与AP2相关。另外，还有一个基因编码与CLE相似的蛋白，可能与CLV3同源。需要进一步研究确定Dgs的候选基因。

4 结论

田间自然突变体Dgs小花有4-7个雄蕊，2个子房，每个子房上各有1对羽状柱头，结实后形成一壳两粒的表型。该性状受1对显性基因调控，Dgs定位于高粱第6染色体Indel2930和SSR7060标记之间，物理距离为404 kb，是一个全新的高粱双粒突变基因。