土壤含水量对三七连作土壤微生物群落的影响

赵林艳 官会林 王克书 卢燕磊 向萍 魏富刚 杨绍周 徐武美

（1.云南师范大学 高原特色中药材种植土壤质量演变退化与修复云南省野外科学观测研究站，昆明 650500；2.西南林业大学环境修复与健康研究院，昆明 650224；3.文山苗乡三七科技有限公司，文山 663000）

土壤含水量是影响微生物活动及其生态功能的关键土壤因子［1-2］。不同微生物菌群对土壤含水量变化具有不同的响应特征，因此，土壤含水量直接或间接地影响着微生物群落组成［3］。研究发现，细菌在土壤环境中的移动和获取营养物质高度依赖于土壤中水膜的运动，因此在干旱胁迫下，细菌群落所受的影响往往要高于真菌群落［4-5］。然而，在湿润土壤中，真菌群落对含水量变化更加敏感［6］。土壤含水量对致病菌群具有直接影响，因此与植物土传病害密切相连［7-9］。研究表明，当土壤含水量高于24.0%时，生姜姜瘟病发病率随土壤含水量的升高而升高［7］；此外，西洋参根腐病与番茄筋腐病的发生也与土壤含水量密切相关［8-9］。

三七（Panax notoginseng）是我国名贵中药材，具有散瘀止血、消肿止痛的功效，然而连作障碍极大地限制了其可持续生产［10］。研究表明，三七连作后会导致土壤微生物群落变化，镰刀菌（Fusarium spp.）等病原真菌相对丰度增加，而具有拮抗病原菌作用的木霉与放线菌等数量减少［1］。连作三七的发病高峰期为6-8月，可能是因为时值雨季，降水丰沛，土壤含水量高，引发三七根腐病害［11-12］。当前，针对三七连作障碍的消减研究主要侧重于部分土壤理化因子与肥力改良方面［13］，而通过田间水分管理消减三七连作障碍的相关研究还鲜见报道。

本课题组前期研究表明，当雨季土壤含水量为25%-35%时，三七存活率与土壤含水量呈显著负相关［10］；然而，其内在机理，特别是土壤微生物群落与关键致病菌群对土壤含水量的响应变化仍不清楚。因此，本研究以8年三七连作土壤为对象，通过室内土培实验与高通量测序分析，探索土壤含水量影响连作三七根腐病害的内在机理，揭示三七发病高峰出现在雨季的主要原因，为从田间水分管理的角度消减三七连作障碍提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试土壤采自云南文山苗乡三七科技示范园（23° 31' 44.48″ N，104° 19' 13.65″ E），三七连作 8 年，其基本理化性质为：pH 6.01，电导率201.33 μS/cm，有效氮含量26.63 mg/kg，有效磷含量18.21 mg/kg，有效钾含量157.52 mg/kg。准确称取3 000 g（干重）三七连作土壤于直径14 cm、高16 cm的实验盆中，采用称重法设置4个土壤含水量梯度，分别为10%（W1）、20%（W3）、30%（W3）与 40%（W4），每个处理重复3次。在温室内自然培养70 d，随后采集一部分土样置于-80℃冰箱保存，用于微生物群落高通量测序分析，另一部分土样自然风干后，用于土壤理化性质的测定。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性质 风干土壤过2 mm筛后，参照《土壤农化分析》一书进行理化因子测定［14］。土壤pH使用pH计（雷磁PHS-25）进行测定；电导率（EC）使用EC计（COMBI 5000）进行测定；铵态氮（NH4+-N）与硝态氮（NO3--N）含量使用连续流动分析仪（Seal Analytical AA3）进行测定；有效磷（AP）含量使用钼锑抗比色法进行测定；有效钾（AK）含量使用连续流动火焰分光光度计（AA3，Model 410）进行测定。

1.2.2 土壤总DNA提取与高通量测序 称取1 g土壤样品，利用DNA提取试剂盒（NucleoSpin Kit，Macherey-Nagel GmbH，Germany）提取微生物总DNA。细菌16S rRNA V3-V4区使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）进行扩增；真菌ITS片段使用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）进行扩增。PCR扩增片段采用AMPure XP试剂盒（Beckman Coulter Life Sciences，USA）和QuantiFluorTM-ST荧光定量系统（Promega，USA）进行纯化和定量。采用Illumina HiSeq 2500 PE250进行高通量测序。

1.2.3 数据分析 使用FLASH v1.2.7［15］对双端测序获得的序列进行拼接，并用Trimmomatic［16］软件对序列进行质控过滤，使用UCHIME v4.2［17］鉴定并去除嵌合体，使用UPARSE［18］软件按97%的序列相似度划分 OTUs（operational taxonomic units）。使用RDP软件以细菌16S rRNA Silva数据库（http://www.arb-silva.de）和真菌ITS UNITE数据库（https://unite.ut.ee/）为参考，对OTU进行分类注释。使用MOTHUR［19］软件计算各土壤样品微生物多样性，包括OTU丰富度、Chao1指数、Shannon指数与系统发育多样性指数（phylogenetic diversity，PD）。

利用单因素方差分析比较不同土样理化性质的差异显著性；利用Bray-Curtis距离指数进行不同微生物群落非度量多维尺度（NMDS）分析与相似性分析（ANOSIM）。以上分析均利用R软件包“vegan”与SPSS 16.0统计软件（SPSS Inc.，Chicago，IL）进行［20-21］。

2 结果

2.1 土壤含水量对微生物群落组成的影响

在门分类水平上，子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为三七连作土壤中优势真菌类群。W1处理下子囊菌门相对丰度最高且显著高于其他处理（图1-A）；担子菌门相对丰度随土壤含水量的增加而升高。变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）为优势细菌类群，其相对丰度在不同处理下均无显著差异（图1-B）。在属分类水平上，镰刀菌属（Fusarium）、木霉属（Trichoderma）和被孢霉属（Mortierella）为优势真菌类群，在W1中占比分别为38.34%、11.86%与3.33%，在W2中占比分别为39.53%、13.75%与7.13%，在W3中占比分别为3.89%、35.21%与5.53%，在W4中占比分别为7.01%、15.69%与4.51%。单因素方差分析与Duncan多重比较表明，W3和W4处理下镰刀菌属相对丰度显著低于W1和W2（P＜0.01），且W3处理下其相对丰度最低。然而，W3处理下，木霉属的相对丰度最高，且显著高于其他处理。W2处理下，被孢霉属的相对丰度最高，且显著高于W1（图2）。异多棒菌属（Xenopolyscytalum）与紫孢霉属（Purpureocillium）的相对丰度随土壤含水量的增加而显著降低（P＜0.05）。W3处理下，青霉属（Penicillium）的相对丰度最低，但与W2相比无显著差异（图2）。鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和Escherichia_Shigella为属分类水平的优势细菌类群，在W1中占比分别为8.26%与5.37%，在W2中占比为分别10.03%与8.62%，在W3中占比分别为4.18%与0.69%，在W4中占比分别为4.66%与0.13%。W2处理下，鞘氨醇单胞菌属和Escherichia_Shigella的相对丰度显著高于W3与W4（P＜0.05）。

图1 不同含水量处理下土壤微生物门分类水平的相对丰度Fig.1 Relative abundances of microorganisms at the phylum level under different soil moisture treatments

图2 不同含水量处理下土壤代表性微生物属的相对丰度Fig.2 Relative abundances of soil representative microbial genera under different soil moisture treatments

2.2 土壤含水量对微生物群落alpha多样性的影响

对12个土壤样品进行高通量测序共获得2 096 786条真菌ITS序列和949 300条细菌16S rRNA序列，根据97.0%的相似度划分OTU，共得到真菌OTU 1 058个，隶属于8门、30纲、71目、148科、276属、303种；共得到细菌OTU 1 972个，隶属于33门、91纲、203目、343科、633属、696种。不同处理下均有分布的真菌OTU数为178个，W1特有OTU数为110个，W2为113个，W3为94个，W4为160个。不同处理下均有分布的细菌OTU数为1 551个，W1和W2无特有OTU，W3特有OTU数为51个，W4为18个（图3）。由于不同土样测序量存在差异，故用稀疏标准化（rarefaction）的方法比较不同微生物群落OTU丰富度（OTU richness）（图4）。W4处理下真菌OTU丰富度较高，但与其他处理相比无显著差异（P＞0.05，图5），Chao1、Shannon与PD多样性指数随土壤含水量的增加呈升高趋势；细菌多样性指数在不同处理下均无显著差异（P＞0.05，图5）。

图3 不同土壤含水量处理下共有和特有的OTU数量Fig.3 Number of shared and unique OTUs under different soil moisture treatments

图4 不同含水量处理下土壤真菌与细菌OTU丰富度的稀疏曲线Fig.4 Rarefaction curves for fungal and bacterial OTU richness under different soil moisture treatments

图5 不同土壤含水量处理对微生物群落alpha多样性的影响Fig.5 Alpha diversities of soil microbial community under different soil moisture treatments

2.3 土壤含水量对微生物群落beta多样性的影响

基于Bray-Curtis距离指数的NMDS分析结果表明，W1和W2具有相似的真菌群落特征，且与W3、W4呈明显的分化格局（图6-A）。与真菌群落相比，细菌群落分化相对较小（图6-B）。ANOSIM分析表明，不同土壤含水量处理下，真菌、细菌群落组间距离均高于组内距离（P＜0.05；图6-C，D）；与细菌群落相比，真菌群落组间分化更大，与NMDS分析结果一致。

图6 基于Bray-Curtis距离指数的不同处理间微生物群落NMDS分析和ANOSIM分析结果Fig.6 NMDS and ANOSIM results of microbial communities under different treatments based on Bray-Curtis distance

2.4 土壤含水量对相关土壤因子的影响

不同土壤含水量处理对pH、EC值与AP、AK含量均未产生显著影响，但对NH4+-N和NO3--N含量具有显著影响（P＜0.01，表1）。Duncan多重比较分析表明，当土壤含水量达到40%时，土壤中NH4+-N含量显著增加，而NO3--N含量显著降低（图7）。

图7 不同土壤含水量处理对NH4+-N与NO3--N含量的影响Fig.7 Effects of different soil moisture treatments on the contents of soil NH4+-N and NO3--N

表1 不同土壤含水量处理影响三七连作土壤理化性质的单因素方差分析结果Table 1 Results of one-way ANOVA for the soil physicochemical properties under continuous cropping of P.notoginseng with different moisture treatments

2.5 土壤理化性质与优势微生物菌群的关联性

利用冗余分析（RDA）探索土壤含水量（MC）、pH、EC值、NH4+-N、NO3--N、AP、AK含量与代表性微生物属分布的关联性。针对真菌类群的RDA分析表明，前两个约束轴（RDA1与RDA2）的解释率分别为73.19%与9.29%，土壤含水量与木霉属、被孢霉属的分布呈正相关，与镰刀菌属、紫孢霉属、异多棒菌属的分布呈负相关（图8-A）。针对细菌类群的RDA分析表明，RDA1与RDA2的解释率分别为48.89%与12.01%。土壤含水量与Ramlibacter等的分布呈正相关，与鞘氨醇单胞菌属和Escherichia_Shigella的分布呈负相关（图8-B）。

图8 不同土壤含水量处理下真菌（A）和细菌（B）群落的RDA分析结果Fig.8 RDA analysis of soil fungal（A）and bacterial community（B）under different moisture treatments

3 讨论

土壤含水量变化不仅影响养分元素的物理扩散与化学形态转化［22］，同样也影响着土壤微生物群落组成与生态功能［3］。本研究发现，随着土壤含水量的增加，三七连作土壤pH、EC值与AP、AK含量均无显著变化，但显著增加了NH4+-N含量，降低了NO3--N含量，主要是因为土壤含水量较高时影响了土壤透气性，进而抑制了硝化作用，促进了铵态氮的积累，并导致硝态氮含量降低［23］。Chen等［24］也研究发现，随着土壤含水量增加，铵态氮含量呈升高趋势。研究表明，土壤中NH4+的积累会对三七生长产生胁迫，并抑制植株的生长与抗病害能力［25］。

本研究发现，真菌多样性随土壤含水量的增加而增加，而细菌多样性的变化不显著，且不同处理下真菌群落分化更为明显，表明真菌群落对三七连作土壤含水量变化的响应更加敏感；然而，其内在机理，特别是与三七连作障碍的关联性，还有待进一步探索。鞘氨醇单胞菌属和Escherichia_Shigella的相对丰度在土壤含水量为20%时最高，RDA分析结果显示，其与土壤含水量和NH4+-N含量呈负相关，而与NO3--N含量呈正相关。已有研究表明，鞘氨醇单胞菌属和Escherichia_Shigella与氮素循环密切相关，因此当土壤含水量较高时，其相对丰度降低，可能影响了三七连作土壤氮素转化，进而导致土壤铵态氮的积累与硝态氮含量降低［26-27］。

异多棒菌属、紫霉属和青霉属等真菌的相对丰度随土壤含水量的增加而显著降低。异多棒菌属在纤维素降解方面发挥着重要作用［28］；紫霉属和青霉属具有促进植物生长的功能［29-30］，同样也是具有生防作用的真菌［31-32］。此外，土壤含水量为20%时，镰刀菌属相对丰度最高，当含水量达30%时，其相对丰度大幅降低。已有研究表明，土壤湿度越大，尖孢镰刀菌（F.oxysporum）丰度越低［33］；镰刀菌属真菌在土壤含水量为15%左右时生长状况最佳［34］，结合本研究结果，说明较低的土壤含水量（＜20%）有利于镰刀菌属的生长繁殖。研究表明，镰刀菌属是三七根腐病株根际土壤中的主要菌群，其中尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌（F.solani）和柔毛镰刀菌（F.flocciferum）等病原真菌均可导致三七根腐病害［35-37］。在本研究中，当土壤含水量为30%时，镰刀菌属的相对丰度大幅降低，而木霉属的相对丰度大幅升高。木霉属在土壤中的生态作用主要是分解植物残留物，也可通过产生抗真菌代谢物、空间和营养竞争、分泌细胞壁降解酶，并利用寄主菌丝为营养源等抑制病原菌的生长［38-39］。木霉适宜生长在潮湿的环境中［40］，已有研究表明，当土壤含水量为32%-42%时，显著促进了哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的生长，并降低了豆科植物病害程度［41］。王勇等［42］研究表明，三七植株以雨季根腐病害最为严重，文增叶［43］和王朝梁等［44］研究指出，镰刀菌是造成三七根腐病最主要的病原菌，抑制镰刀菌的生长是消减三七连作障碍的关键措施。因此，通过合理调节土壤含水量，抑制致病菌并促进有益微生物的生长，改善微生物群落，是防控三七根腐病害的有效措施。本研究表明，土壤含水量在30%左右时，镰刀菌属相对丰度最低，木霉相对丰度最高，有利于防控三七根腐病害；然而，这与我们的田间调查结果存在一定的差异［10］，可能是复杂的田间环境所致，因此还需进一步开展大田试验进行验证。

4 结论

不同土壤含水量处理显著影响了土壤真菌群落，对细菌群落的影响相对较小。当土壤含水量低于20%时，有利于致病菌镰刀菌等的生长，当土壤含水量为30%时，促进有益菌木霉等的生长，抑制镰刀菌的生长。此外，本研究还揭示，当土壤含水量为40%时，显著促进了土壤NH4+-N的积累。因此，土壤含水量过高或过低都不利于防控三七根腐病害，将含水量控制在30%左右为佳。