2019年昆明市输入性登革热病例流行病学和病原学特征分析

王雪菲，田荣，陈志辉，杨明东，郭晓芳

1.云南省寄生虫病防治所，云南省虫媒传染病防控重点实验室，云南 普洱 665000；2.昆明市疾病预防控制中心

登革热（dengue fever, DF）是由登革病毒（den‐gue virus, DENV）感染引起的蚊媒传染病，传播媒介主要为白纹伊蚊和埃及伊蚊[1]。登革病毒隶属黄病毒科黄病毒属，分为DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4四种血清型[2]，其中，DENV-1分为5个基因型（Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型）[3]，DENV-2则分为6 个基因型（Asian/American、Asian Ⅰ、Asian Ⅱ、Cosmopolitan、American 和 Sylvatic）[4]。登革热广泛流行于全球热带和亚热带国家或地区，目前已有美洲、东地中海、西太平洋、欧洲、非洲和东南亚的100多个国家和地区报告了登革热的流行[5]，亚洲国家的疾病负担占全球的70%[6]，我国广东、云南、福建、浙江等多省均有流行[1]。

云南省紧邻老挝、缅甸和越南等登革热广泛流行的东南亚国家，是我国主要的登革热流行地区之一，十余年来，均有输入性和（或）本地病例的报道[7-9]。昆明市作为云南省省会和我国沟通东南亚地区的主要交通枢纽之一，输入性登革热病例的报道也呈逐年上升趋势[8,10-11]，但有关血清型或基因型的研究较少，仅2013—2015年对昆明市输入性登革热病例开展了E 基因序列分析，且分析的样本量较少[12-13]。本研究分析了2019年昆明市输入性登革热病例的流行病学特征，同时对部分病例进行了病毒血清型和基因型测定，并对所得序列进行进化分析，为昆明市输入性登革热的防控提供流行病学和病原学依据。

1 材料与方法

1.1 资料来源 按照《全国登革热监测方案》对2019 年昆明市输入性登革热病例（包括实验室诊断病例和临床诊断病例）开展个案调查，病例的诊断依据为《登革热诊断》（WS 216—2018）[14]。病例个案调查以问卷调查的形式开展，问卷变量包括病例姓名、性别、年龄、职业、登革热疫区旅居史等。

1.2 病毒血清分型 采集2019年1—6月昆明市部分输入性登革热病例血清样本，采用美国公司生产的Cortez NS1 抗原检测试剂作为病例临床诊断试剂，NS1 抗原阳性血清样本采集后置于-20 ℃冰箱保存，随后冷链运输至实验室，-80 ℃保存待检。采用天隆科技（西安）有限公司生产的半自动核酸提取仪和病毒DNA/RNA 提取试剂盒（磁珠法）提取病毒RNA，获得的RNA 立即用于后续试验，剩余RNA-80 ℃保存。分型引物和探针参考《登革热诊断》（WS 216—2018）[14]设计合成。采用实时荧光RT-PCR对待测样本进行血清型测定。

1.3 E 基因测定及进化分析 采用天根反转录试剂盒将提取的RNA 逆转录合成得到病毒第一链cDNA。参考有关文献[7]设计合成DENV-1 和DENV-2 E 基因扩增引物，以上述步骤合成的cDNA为模板进行E 基因序列扩增，PCR 扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，阳性扩增产物送测序公司进行双向测序以获得相应E基因序列。测序结果使用DNAStar 软件下的SeqMan 模块进行序列拼接，所得序列在NCBI网站的Blast进行比对并选取相似性最高的序列。进化分析所用的参考序列均下载自NCBI 数据库，包括比对后选取的相似序列、云南省近年流行株、柬埔寨近年流行株、泰国近年流行株和各基因型代表序列。采用ClustalW 软件进行多序列比对，Mega 软件构建Neighbor-Joining 进化树，进化树构建采用Kirmura2-parameter 模型，bootstrap设置为1 000。

1.4 统计分析 采用Excel 2019 建立数据库，并进行描述性分析。

2 结 果

2.1 总体情况 2019 年昆明市共报告输入性登革热病例400 例。其中，实验室诊断病例55 例，占13.75%；临床诊断病例345例，占86.25%。

2.2 流行病学特征

2.2.1 来源地分布 境外输入297 例（占74.25%），以东南亚国家为主，柬埔寨（187例）、缅甸（38例）和老挝（28 例）为主要来源国；境内输入99 例（占24.75%），以云南省西双版纳（93例）输入为主；未知来源地4例（占1.00%）。见表1。

表1 2019年昆明市输入性登革热病例来源地分布

2.2.2 时间分布 2019 年昆明市全年均有输入性登革热病例报告，5—10 月为输入性病例报告高峰，其中10月病例数最多，占20.75%（83/400）。见图1。

2.2.3 人群分布 400例输入性登革热病例中男性267 例，女性 133 例，男女性别比为 2.01∶1。各年龄组均有报告病例，年龄最小6 月，最大83 岁，其中，20~29 年龄组报告病例数最多，共135 例（占33.75%）。职业以家务及待业人员、商业服务人员、干部职员、农民和工人为主，分别为78 例（占19.50%）、56例（占14.00%）、52例（占13.00%）、46例（占11.50%）和43例（占10.75%）。见表2。

表2 2019年昆明市输入性登革热病例人群分布

2.3 DENV 血清分型 共采集DENV NS1 抗原阳性输入性病例血清60 例，输入地分别为柬埔寨（49例，占81.67%）、老挝（1 例，占1.67%）、缅甸（3 例，占5.00%）、越南（3例，占1.67%）、泰国（1例，占1.67%）和非洲国家（3例，占5.00%）。DENV 核酸检测阳性34 例，其中输入来源为柬埔寨的32 例（28 例为DENV-1 型，4 例为 DENV-2 型），越南 1 例（DENV-2型），泰国1例（DENV-1型）。

2.4 DENV 基因分型和 E 基因进化分析 34 例DENV 核酸检测阳性样本扩增得到6 条DENV-1 E基因序列（5 条源自柬埔寨，1 条源自泰国）和2 条DENV-2 E基因序列（均源自柬埔寨）。

6 条DENV-1 E 基因序列核苷酸相似性为96.63%～100.00%，与选取参考序列的进化分析结果显示，6株DENV-1均属于基因Ⅰ型，分别位于3个不同的进化分支（Lineage 1、Lineage 2 和Lineage 3）。各序列分别有与其在遗传上高度相似的毒株，Lin‐eage 1 分支中KM67 和KM71 E 基因序列分别和2019年广东柬埔寨输入株（MN921287、MN921259）同源性最高，核苷酸相似性分别为100.00%和99.93%，而KM68 E 基因序列则和2019 年老挝流行株（MW228042）同源性最高，核苷酸相似性为100.00%；Lineage 2 分支中，KM36 和 KM37 E 基因序列和2019 年南昌株（MN894235）同源性最高，核苷酸相似性为100.00%；Lineage 3分支中，泰国输入性病例的病毒KM7 E 基因序列与2019 年上海株（MT856309）和2018 年泰国流行株（MN955621）同源性最高，核苷酸相似性分别为99.87%和99.66%。见图2。

2 条DENV-2 E 基因序列核苷酸相似性为99.73%，与参考序列的进化分析结果显示，2条序列均属AsianⅠ基因型，KM28 和KM61 E 基因序列分别与2019 年广东柬埔寨输入株（MN923115、MN915188）同源性最高，核苷酸同源性均为99.93%。见图3。

3 讨 论

通过对2019 年昆明市输入性登革热病例的流行病学特征分析发现，该地登革热病例以境外输入为主，占总病例数的74.25%，主要输入来源为柬埔寨、缅甸和老挝等登革热疫情高发的东南亚国家。其中，柬埔寨是2019年昆明市输入性病例的主要来源国，占总输入性病例数的46.75%，这可能与2019年柬埔寨登革热疫情严重，报告病例数大幅超过去年同期[15]，且昆明与柬埔寨间的人员往来日益频繁等因素有关。输入性登革热病例全年均有报道，报告高峰为5—10 月，要早于云南省登革热高发季节（8—11月）[16]，这可能与柬埔寨等东南亚国家登革热流行季节在5—10 月有关[17-19]。输入性病例男性多于女性，职业以家务及待业人员、商业服务人员、干部职员、农民和工人为主，提示该类人群为昆明市登革热防控的重点人群。

本研究共检测出2 个血清型和2 种基因型，2 种基因型均属东南亚地区流行的优势基因型[20-22]，系统进化分析也发现本研究序列和东南亚流行株、我国东南亚输入株高度同源。由于周边国家登革热广泛流行，我国广东、云南、福建、浙江等地也多次报告了来自东南亚国家的输入性病例，且部分省份暴发了由输入性病例引起的本土聚集性疫情[23-27]。昆明市是连接我国与东南亚国家的重要门户，便利的交通为东南亚国家登革热病例的输入提供了渠道。2019 年昆明市未发生由输入性病例引起的本地散发、暴发，且无本地登革热病例报告，这主要归因于该地对输入性病例的早发现、早诊断和早隔离。登革热传播媒介白纹伊蚊在云南省广泛分布[28]，昆明市也有监测到伊蚊的相关报道[29-30]，虽然昆明市伊蚊密度较低且暂未发现优势蚊种埃及伊蚊[31]，但仍存在由输入性病例引起本地登革热暴发的风险。

研究结果提示，对境内外输入性病例的监测依然是昆明市登革热防控工作的重点，应密切关注东南亚地区登革热流行形势，提前做好昆明市登革热防控工作部署。同时，需加强对疫情高发国家往来重点人群的监测，提高输入性病例的发现和报告能力，及时处置输入性疫情，防止由输入性病例引起的本地登革热疫情暴发。