氟啶虫酰胺对3种水生生物的急性毒性

罗泽伟，孔玄庆，雷 琪，朱雄梅，金晨钟*

(1.湖南人文科技学院农田杂草防控技术与应用协同创新中心，湖南娄底 417000;2.湖南化工研究院国家农药创制工程研究中心/湖南省农用化学品重点实验室,湖南长沙 410014；3. 湖南化研院检测技术有限公司，湖南长沙 410014)

氟啶虫酰胺是一种吡啶酰胺类昆虫生长调节剂类杀虫剂，能够高效防治作物上的刺吸式口器害虫，氟啶虫酰胺对蚜虫类防治最为高效。氟啶虫酰胺因其特殊的作用机理，与其他杀虫剂没有交互抗性，良好的防治效果，在我国销量和使用量日益剧增。

目前关于氟啶虫酰胺的研究主要集中在蚜虫的防效，高德良等在施用10%氟啶虫酰胺水分散粒剂14 d后，20、40、60 mg/L处理组的防效分别为94.2%、98.4%、99.2%。赵娟娟等施用30%氟啶虫酰胺和20%啶虫脒复配后对苹果树绣线菊蚜的防治效果在药后第3天和第10天高达99.7%、98.36%。但关于氟啶虫酰胺对环境生物的影响较少。据报道，氟啶虫酰胺对蜜蜂的毒性为低毒，对蜜蜂经口和接触毒性的48 h-LD值均>100 μg/蜂。闫浩浩等比较了不同剂型氟啶虫酰胺对家蚕的急性毒性，98%氟啶虫酰胺原药、10%氟啶虫酰胺水分散粒剂、10%氟啶虫酰胺悬浮剂和 8%氟啶虫酰胺可分散油悬浮剂对家蚕为低毒，氟啶虫酰胺与呋虫胺和氟啶虫酰胺与联苯菊酯的复配制剂分别为高毒和剧毒。目前关于氟啶虫酰胺对水生生物的毒性研究鲜见报道，故开展氟啶虫酰胺对水生生物毒性的研究，评价氟啶虫酰胺对水生生物的危害具有重大意义。

笔者以氟啶虫酰胺为试验药剂，参照《化学农药环境安全评价试验准则》和OECD化学物质对水生生物毒性试验方法，研究氟啶虫酰胺对斜生栅藻、大型溞和斑马鱼的急性毒性，旨在为氟啶虫酰胺的水生生态环境风险评估提供基础数据。

1 材料与方法

斜生栅藻()，引种于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。在温度(23±1) ℃、光周期16 h∶8 h(L∶D)的培养条件下使用水生4号培养基对斜生栅藻转接3次后，选择培养72 h的斜生栅藻用于试验。

大型溞()，引种于中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所。在(22±1) ℃、光周期16 h∶8 h(L∶D)的培养条件下培养3代以上，选择出生时间6～24 h、活泼健康的幼溞进行试验。

斑马鱼()，购于长沙市徐记水族馆。在(24±1)℃、光周期16 h∶8 h(L∶D)的培养条件下培养8 d，驯养期间每天喂食2次。试验前24 h停止喂食，试验期间不喂食，选择活泼健康的斑马鱼进行试验。

主要试剂：氟啶虫酰胺，青岛东生药业有限公司提供；甲醇(色谱纯)、丙酮(分析纯)，购于国药集团化学试剂有限公司；水生4号培养基和ISO标准稀释水，实验室配制，现配现用。

主要仪器：LC-20A型高效液相色谱仪带二极管阵列检测器和化学工作站(日本岛津公司)、AUY220型电子天平 (日本岛津公司)、烧杯、容量瓶等。

试验条件与斜生栅藻、大型溞和斑马鱼的培养条件基本相同，光照/黑暗时间比为16 h∶8 h(L∶D)，培养和试验环境温度控制在22～24 ℃。

氟啶虫酰胺对斜生栅藻的急性毒性试验。参照《化学农药环境安全评价试验准则 第14部分：藻类生长抑制试验》，根据预试验结果，以水生4号培养液为稀释液设置氟啶虫酰胺浓度依次为39.00、50.70、65.91、85.68、111.39 mg/L，接种藻液后，藻细胞初始浓度为1.00×10个/mL，同时每个处理设置3个重复并设置空白对照。试验开始后，采用血球计数板计数藻细胞浓度，在第0、24、48、72 h记录各处理组藻细胞生长抑制情况。

氟啶虫酰胺对大型溞的急性毒性试验。参照《化学农药环境安全评价试验准则 第13部分：溞类急性活动抑制试验》，根据预试验结果，以ISO标准稀释水设置氟啶虫酰胺浓度依次为19.29、23.15、27.78、33.33、40.00 mg/L，每个处理重复3次，并设置空白对照组，每个处理放置10只幼溞。试验开始后，在第24、48 h观察并记录大型溞的生长情况。

氟啶虫酰胺对斑马鱼的急性毒性试验。参照《化学农药环境安全评价试验准则 第12部分：鱼类急性毒性试验》，根据预试验结果，以去氯处理24 h以上曝气自来水设置氟啶虫酰胺浓度依次为50.0、60.0、72.0、86.4、103.7 mg/L，同时设置空白对照，不设重复，每次缸内放置10条健康活泼的斑马鱼。试验开始后，在第24、48、72和96 h观察并记录斑马鱼生长情况，并及时清理死鱼。

为获得更准确可靠的试验结果，参照马明等方法并稍作改动。

UPLC检测条件：高效液相色谱仪(岛津-LC-20AT型，带紫外检测器和 LC solution 化学工作站)。色谱柱，C柱，250 mm×4.6 mm (i.d)不锈钢柱，5 μm；流动相，乙腈-水 (50/50,)；流速，1.0 mL/min；检测波长，265 nm；柱温，40 ℃；进样量，20 μL；保留时间，约3.9 min。

建立标准曲线：准确称取0.050 5 g氟啶虫酰胺标准品置于小烧杯，加少量乙腈溶解，转至100 mL容量瓶中，用乙腈冲洗烧杯多次并转至容量瓶中，再用乙腈定容至刻度，配制成500 mg/L标准溶液。然后乙腈稀释，配制成氟啶虫酰胺10、20、40、60、80、120 mg/L浓度的系列标准溶液，分别取上述系列标准溶液按照上述UPLC检测条件进行检测，每个浓度重复3次。

样品前处理：用玻璃棒搅均匀后静置3 min，取试验水样过0.45 μm滤膜，上机检测。斜生栅藻取样时间0、72 h，大型溞取样时间0、48 h，斑马鱼取样时间0、48、96 h。

添加回收：分别取浓度为500 mg/L的标准工作溶液6和22 mL，用试验用水分别定容至100 mL，使水体添加浓度分别为30和110 mg/L 2个添加水平，同时设不加药的空白对照。试验水样按照上述前处理方法进行处理，按照上述UPLC检测条件后检测，每个浓度重复5次，计算添加回收率。

采用SPSS 16.0进行数据处理与分析，以初始浓度值计算氟啶虫酰胺对斜生栅藻、大型溞的半数抑制浓度(EC)和斑马鱼的半致死浓度(LC)。

2 结果与分析

以浓度为横坐标()，峰面积为纵坐标()，进行线性回归分析，得到标准曲线方程为=19 02756-3 48569(=0999 9)。斜生栅藻试验的添加回收率在93.05%～102.63%，相对标准偏差为2.76%和0.58%。大型溞试验的添加回收率在93.85%～100.48%，相对标准偏差为0.98%和2.81%。斑马鱼试验的添加回收率在89.87%～100.75%，相对标准偏差为1.55%和1.74%。试验周期内各组氟啶虫酰胺的质量浓度测定结果见表1。由表1可知，试验过程中浓度变化率未超过20%，符合该试验各验证内容的质量控制要求。

表1 氟啶虫酰胺实测浓度Table 1 Measured mass concentration of flonicamid

试验期间，氟啶虫酰胺处理浓度越高，藻细胞数量越少。染毒24 h后，低浓度藻细胞大小正常，高浓度藻细胞偏小。染毒48 h后，对照组和低浓度处理组藻液呈绿色和黄绿色，85.68、111.39 mg/L处理组藻液无色，表明此浓度处理下藻细胞生长受到抑制。染毒72 h后，39.00、50.70、65.91、85.68、111.39 mg/L处理组藻细胞浓度分别增长88.83、71.17、48.17、25.17、12.67倍，对照组细胞浓度增长104.83倍。

采用初始浓度值计算氟啶虫酰胺对斜生栅藻进行生长抑制毒性的数据分析，以浓度对数为横坐标，抑制率为纵坐标进行拟合，计算其生物量半效应浓度EC，结果见表2。由表2可知，氟啶虫酰胺对斜生栅藻的48 h-EC为77.28 mg/L，72 h-EC为60.16 mg/L。由于24 h时斜生栅藻的最高生长抑制率小于50%，因此不进行数据分析。

表2 氟啶虫酰胺对斜生栅藻生长抑制试验结果Table 2 Results of the growth inhibition test of fludilanamide on Scenedesmus obliquus

试验期间，氟啶虫酰胺处理浓度越高，大型溞活动越迟缓。染毒24 h后，低浓度受抑制溞数较少，高浓度受抑制溞数较多，受抑制的大型溞体色发白，不再透明；各处理组未受抑制溞均游动缓慢。染毒48 h后，19.29、23.15、27.78 mg/L处理组受抑制总溞数为7、13、19只，未受抑制溞游动缓慢，部分溞身体发白。高浓度处理组(33.33和40.00 mg/L)中溞几乎受到了抑制，受抑制溞均身体发白，身体不再透明，轻摇烧杯，观察不到溞游动，未受抑制溞浮于水面，轻摇烧杯，溞缓慢游动。

采用初始浓度值计算氟啶虫酰胺对大型溞进行急性活动抑制毒性的数据分析，以浓度对数为横坐标，抑制率为纵坐标进行拟合，计算各指标的EC，结果见表3。从表3可以看出，氟啶虫酰胺对大型溞的24 h-EC为30.04 mg/L，48 h-EC为25.27 mg/L。

表3 氟啶虫酰胺对大型溞急性活动抑制试验结果Table 3 Results of acute activity inhibition test of fludinamide on Daphnia magna

试验期间，氟啶虫酰胺处理浓度越高，斑马鱼中毒症状越明显。染毒24 h后，低浓度处理组无明显中毒症状，高浓度处理组有部分鱼出现身体失衡和死亡的情况。染毒48 h后，低浓度处理组中斑马鱼情况良好，72.0 mg/L处理组鱼体出现呼吸急促、鱼鳃张合频繁的情况，高浓度处理组死亡鱼数增加。染毒72 h后，所有处理组均出现鱼死亡的情况，低浓度处理组(50.0和60.0 mg/L)未死亡鱼无明显中毒症状，72.0 mg/L处理组中未死亡鱼游动较慢，86.4和103.7 mg/L中未死亡鱼呼吸较急促，鳃张合频繁，中毒症状明显。染毒后约96 h，各处理组的鱼不再继续死亡。

采用初始浓度值计算氟啶虫酰胺对斑马鱼进行急性毒性的数据分析，以浓度对数为横坐标，抑制率为纵坐标进行拟合，计算各指标的LC，结果见表4。从表4可以看出，氟啶虫酰胺对斑马鱼的48 h-LC为91.07 mg/L，72 h-LC为73.91 mg/L，96 h-LC为73.91 mg/L。由于24 h时斑马鱼的最高死亡率小于50%，因此不进行数据分析。

表4 氟啶虫酰胺对斑马鱼急性毒性试验结果Table 4 Results of acute toxicity test of fludinamide to Brachydonio rerio

3 结论与讨论

氟啶虫酰胺作为一种新型的吡啶酰胺类昆虫生长调节剂，在我国杀虫剂市场占有相当重要的地位，随着氟啶虫酰胺销量的持续走高，氟啶虫酰胺对环境生物的影响受到重视。该研究中氟啶虫酰胺对斜生栅藻的48 h-EC为77.28 mg/L，72 h-EC为60.16 mg/L，对大型溞的24 h-EC为30.04 mg/L，48 h-EC为25.27 mg/L，对斑马鱼的48 h-LC为91.07 mg/L，72 h-LC为73.91 mg/L，96 h-LC为73.91 mg/L。参照《化学农药环境安全评价试验准则》中农药对斜生栅藻、大型溞和斑马鱼的毒性等级划分可确定氟啶虫酰胺对斜生栅藻、大型溞和斑马鱼的毒性等级均为低毒。

林涛等发现氟虫双酰胺、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺3种杀虫剂对斜生栅藻为低毒，对大型溞为剧毒，对斑马鱼为低毒，其原因可能是藻类和斑马鱼缺少某种鱼尼丁受体或者与鱼尼丁受体的氨基酸序列相似度低，而大型溞的鱼尼丁受体的氨基酸序列相似度高。该研究中，氟啶虫酰胺对斜生栅藻、大型溞和斑马鱼的急性毒性都很低，其原因可能是氟啶虫酰胺的作用机理独特，对刺吸式口器害虫有很好的拒食活性，对乙酰胆碱酯酶和烟碱乙酰胆碱受体没有作用，使得氟啶虫酰胺对斜生栅藻、大型溞和斑马鱼的毒性较低。

束兆林等研究表明氟啶虫酰胺在白背飞虱低龄若虫高峰期用药，对飞虱有很好的防治效果，且对田间天敌蜘蛛安全性较高。氟啶虫酰胺对人、畜、环境都有很高的安全性，但单一的毒性数据并不能够准确全面反映氟啶虫酰胺对水生生物的风险情况，可根据《环境风险评估指南》对氟啶虫酰胺进行全面的水生生态风险评估。该研究为氟啶虫酰胺进一步环境风险评估提供了生态毒理数据支撑。