菌酶协同发酵对中草药有效成分消化溶出率的影响

侍宝路，王梓旭，胡丹丹，王计伟

(安佑生物科技集团股份有限公司，江苏太仓 215437)

我国拥有丰富的中草药资源和几千年的用药历史经验。中草药作为天然传统药物，富含多种活性物质，具有绿色、安全、低残留等特点，在畜牧业中被应用于养殖动物增强免疫、疾病防治和医药保健。中草药有效成分多分布于植物细胞内和细胞间隙，新鲜药材经干燥后，细胞逐渐萎缩，活性物质呈结晶或无定形状态沉积于细胞内，细胞质膜的半透性丧失，导致胞内物质溶出障碍。植物细胞壁主要是由纤维素、半纤维素、果胶质等大分子构成，而常见的超声波萃取技术、超临界流体萃取技术、酶提取技术等中草药提取技术均是通过破坏植物细胞壁，让中草药有效成分与溶剂接触并溶出提取的过程。发酵中药的本质是利用微生物生长代谢过程中产生的酶类消化植物细胞壁，释放活性物质，提高药效，降低药物副作用，产生新的生物活性物质，达到中草药与益生菌协同增效的效果。

王不留行为石竹科植物麦蓝菜[(Neck.)Garcke]的干燥成熟种子，具有行血通经、催生下乳、消肿敛疮的功效；益母草为唇形科植物益母草(Houtt.)的新鲜或干燥地上部分，具有活血调经、利水消肿、清热解毒的功效；甘草为豆科多年生草本植物，具有补气、止咳、清热解毒、止痛等功效。日粮中添加王不留行可以提高哺乳母猪泌乳性能和抗氧化能力；益母草和甘草在母猪繁殖性能方面发挥有益作用。有研究发现，中草药经益生菌发酵后有效活性成分含量增加；刘洋等研究发现，王不留行和益母草经乳酸菌和酵母菌发酵后，可溶性总黄酮、总生物碱、粗多糖和总皂苷含量分别比未发酵组提高了55.14%、127.28%、55.42%和49.21%。目前，在生物酶法辅助提取中药方面，研究较多的是非淀粉多糖酶，尤其是纤维素酶。前人对发酵中草药成分含量变化的研究，多使用有机溶剂萃取发酵前后的中草药样品，检测活性成分含量，但此方式并不能代表其活性成分的消化溶出效果。该研究通过筛选益生菌和纤维素酶并进行仿生消化处理，评估菌酶协同发酵对中草药有效成分消化溶出率的影响，为发酵中草药应用于母猪生产提供研究基础。

1 材料与方法

试剂。氯化钠、氯化钾、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钠、胃蛋白酶(sigma，P7000)、淀粉酶(Sigma，A3306)、胰蛋白酶(Amersco，0785)、糜蛋白酶(Amersco，0164)；王不留行黄酮苷标准品(批号111853-201704，含量96.9%，购自中国食品药品检定研究院)；甲醇、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

菌种。植物乳杆菌()、产气荚膜梭菌ATCC13142，均为安佑微生物研究所微生物实验室甘油管保存。酵母菌：安佑微生物研究所菌种库酿酒酵母菌7株，编号分别为J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7，均为安佑微生物研究所微生物实验室甘油管保存。非淀粉多糖酶：木聚糖酶，10万U/g，购自武汉新华扬生物股份有限公司；纤维素酶M1、M2、M3和M4，均选购自市场。

原料。玉米粉均为市售，粉碎备用。中草药组方：王不留行、益母草、甘草按4∶3∶3混合，以上中草药均购自亳州药材市场，为饲料级，按上述配方比例混合，粉碎过40目筛，备用。

培养基。乳酸菌培养基：MRS液体培养基；芽孢杆菌培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；酵母菌培养基：马铃薯葡萄糖培养基。固态发酵培养基：按“..”所述中药组方配制中药，将中药和玉米粉按8∶2混合均匀，作为固态发酵培养基。

酵母菌筛选。将7株酵母菌甘油管接种于马铃薯葡萄糖平板上，28 ℃静置培养2 d，挑较大菌落转接于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在温度30 ℃、转速100 r/min的恒温摇床上振荡培养24 h，得培养液，检测活菌数。将培养液在8 000 r/min下离心30 min，弃除沉淀，保留上清液，以产气荚膜梭菌ATCC13142作为指示菌，采用打孔法进行抑菌试验，测量抑菌圈直径。每个菌株进行3个重复，以活菌数和抑菌圈直径为标准筛选出发酵效果较好的酵母菌。

发酵种子液制备。将“..”中筛选出的酵母菌接种至马铃薯葡萄糖液体培养基，枯草芽孢杆菌接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基，在温度30 ℃、转速100 r/min的恒温摇床上振荡培养24 h，作为酵母菌和枯草芽孢杆菌种子液。植物乳杆菌接种至MRS液体培养基中，37 ℃静置培养12 h，备用。

非淀粉多糖酶使用。将酵母菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的种子液、木聚糖酶和纤维素酶M1、M2、M3、M4在水中充分溶解，作为发酵菌液与固态发酵培养基混合，物料发酵初水分约为40%，酵母菌、植物乳杆菌和木聚糖酶在物料中的接种浓度分别为1.0×10CFU/g、1.0×10CFU/g和3 000 U/kg，纤维素酶M1、M2、M3和M4在物料中的接种浓度均为2 000 U/kg。分装至带呼吸阀的发酵袋密封，37 ℃静置发酵5 d，测定发酵后物料中水分、总酸和中性洗涤纤维(NDF)含量，以发酵前样品为空白对照组，计算NDF降解率，每个处理进行3个重复，筛选出效果较好的纤维素酶。

体外消化处理。参考廖睿等和Regmi等方法，略有改动，具体如下：

(1)胃缓冲液。称取2.59 g氯化钠和0.25 g氯化钾，加350 mL去离子水溶解，用2 mol/L的盐酸在39 ℃下调节pH至2.0，冷却后将上述溶液转入500 mL容量瓶中定容。

(2)小肠缓冲液。称取0.52 g无水磷酸氢二钠、2.57 g无水磷酸二氢钠和青霉素12万U，加40 mL去离子水溶解，39 ℃下用磷酸(1 mol/L)或氢氧化钠(1 mol/L)调节pH至6.30，冷却后转入50 mL容量瓶中定容。

(3)模拟胃液(胃蛋白酶活性737.5 U/mL)。称取胃蛋白酶147.5 kU，溶解于200 mL pH 2.0的胃缓冲液中，缓慢搅拌至溶解，临用前配制。

(4)模拟小肠液。称(量)取淀粉酶41.41 kU、胰蛋白酶12.82 kU、糜蛋白酶1.62 kU，溶解于17 mL去离子水中，缓慢搅拌至溶解15 min以上，临用前配制。

称取发酵前后样品1 g(精确到0.001 g)于圆底烧瓶中，加入10 mL模拟胃液，39 ℃水浴消化4 h；加入6 mL小肠缓冲液、1.6 mL模拟小肠液，39 ℃水浴消化16 h；将未消化的残渣收集抽滤装置中，使用已称重的定量滤纸过滤，并使用去离子水清洗；将残留物与滤纸一起在(103±2)℃下烘至绝干，称重，每个处理进行3个重复，测定消化处理前后样品中王不留行黄酮苷含量。

常规指标检测。饲料中的水分、总酸和粗蛋白质含量测定分别按照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—1994和GB/T 12456—2008 方法；中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)参照 Van Soest 等方法进行测定；pH采用PHS-3C型酸度计直接测定。乳酸菌总数和酵母菌总数测定分别参照 GB 4789.35—2016和GB 4789.15—2016方法。

王不留行黄酮苷含量测定。

对照品溶液的制备。取王不留行黄酮苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备。取发酵前后样品(过三号筛)约1.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定方法。参照《中国药典》2015年版方法，其中，色谱柱为Agilent HC-C柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速1 mL/min，检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。测定消化处理前后样品中王不留行黄酮苷含量，每个处理3个重复，计算出王不留行黄酮苷消化溶出率，并对比发酵前后王不留行黄酮苷含量的变化。

式中，为消化前样品质量(g)；为消化前样品中王不留行黄酮苷含量(mg/kg)；为消化后样品质量(g)；为消化后样品中王不留行黄酮苷含量(mg/kg)。

2 结果与分析

从表1可以看出，酵母菌J2、J3和J6 对产气荚膜梭菌ATCC13142具有杀菌作用，其他酵母菌株无抑菌效果，综合考虑，选用抑菌效果较好的酵母菌J3作为发酵菌株。

从表2可以看出，与发酵前CK组相比，发酵原料经37 ℃静置发酵5 d后，纤维素酶M3的总酸含量和NDF降解率分别为3.14%和 10.01%，为发酵效果较好的纤维素酶产品。

表1 酵母菌筛选试验Table 1 Yeast screening test

表2 非淀粉多糖酶筛选Table 2 Screening of non-starch polysaccharide enzymes %

从发酵前后王不留行黄酮苷的体外消化溶出率(表3)可以看出，经发酵后，王不留行黄酮苷消化溶出率略升高，消化溶出率由94.55%提升至96.46%。

表3 发酵前后王不留行黄酮苷消化溶出率比较Table 3 Comparison of the digestion and dissolution rate of flavonoid glycosides in Vaccaria segetalis before and after fermentation

3 讨论

酿酒酵母作为常见的益生菌，具有较高的营养价值，以干性活酵母、酵母细胞壁、酵母核苷酸等产品形式应用于畜牧养殖中。该试验中，有3组酿酒酵母菌培养液对产气荚膜梭菌ATCC13142有明显的抑菌效果，表现出杀菌特性。酵母菌的杀菌特性主要归因于两方面：一是营养竞争，二是产有机酸、乙醇、分泌毒素蛋白、过氧化氢等抑菌物质。毒素蛋白是一种分泌的胞外蛋白或糖蛋白，它会破坏敏感菌的细胞膜，杀菌酵母常用于食品保鲜。在母猪饲粮中添加适量酿酒酵母，可改善母猪体况，缩短产仔和发情间隔，提高初乳品质，改善母猪肠道健康，显著降低哺乳期间仔猪腹泻率和死亡率。因此，从发酵料的酵母菌总数和抑菌效果综合考虑，确定酿酒酵母J3作为发酵中草药的酵母菌株。

中草药的生物酶解辅助提取法是利用酶反应的催化活性和高度专一性等特点，选择相应的生物酶，水解植物细胞壁中纤维素、半纤维素、果胶质等物质，以促进有效成分扩散溶解的方法，干燥植物体中近50%为纤维素，纤维素酶发挥重要作用。纤维素酶是能将纤维素水解的酶的总称，是一类复杂酶体系总称，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，常用滤纸酶活(FPA，filter paper activity)作为生化转化的应用指标，其中外切纤维素酶是最关键的限制性单酶因子，作用机理：内切葡聚糖酶主要作用于纤维素的非结晶区，将纤维素长链降解为小分子纤维素或寡糖链；外切葡聚糖酶又称作纤维二糖水解酶，与内切葡聚糖酶协同作用于纤维素的结晶区，将纤维素链剥离并水解β-1，4-糖苷键释放纤维二糖，经β-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖。植物纤维中木聚糖在纤维素酶作用于纤维素时形成了一定的空间位阻效应，木寡糖对于纤维素酶具有一定程度的抑制作用，因此，该试验使用木聚糖酶能够提高纤维素酶解效率，降低纤维素酶的使用量。该试验条件下，纤维素酶M3组降解NDF效果较好，且总酸含量较高，表明与其他组相比，纤维素酶M3中各成分酶组成较为合适，具体还需进一步研究。该试验中各组纤维素酶对NDF含量降解效果有限，可能原因是王不留行、益母草和甘草均为草本植物，生长后期木质化程度较高，木质素限制水解酶接近多糖底物，以及通过非选择性吸附使酶失活，从而限制酶解效果。

基于体外酶法的体外消化技术一直作为动物营养研究的重要手段之一。田树海等研究发现，不同中草药的干物质体外消化率有很大差异；陈皮和枳壳纤维含量高，干物质消化率较低，应该使用提取物；当归、党参中纤维含量少，干物质消化率较高，可以直接添加到日粮中。该试验条件下，王不留行黄酮苷体外消化溶出率均很高，表明王不留行可直接添加到日粮中饲喂，添加纤维素酶和木聚糖酶后经乳酸菌和酵母发酵，对王不留行黄酮苷消化溶出率有一定促进作用，中草药混合物中其他有效成分消化溶出率变化情况有待进一步试验研究。

4 结论

该试验将王不留行、益母草和甘草按4∶3∶3混合成中草药原料，添加玉米粉作为辅料，以产气荚膜梭菌ATCC13142作为指示菌，筛选出酿酒酵母J3的杀菌效果最佳，纤维素酶M3降解 NDF效果较好，降解率为10.01%。发酵原料含水量为40%，植物乳杆菌和酿酒酵母J3分别接种1.0×10和1.0×10CFU/g，纤维素酶M3和木聚糖酶的添加量分别为2 000 和3 000 U/kg时，37 ℃发酵5 d后，王不留行黄酮苷体外消化溶出率由94.55%提升至95.66%，可直接用于母猪日粮中。