应力纤维调控干细胞分化作用机制的研究进展

童华 傅窈窈

(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼耳鼻整形外科 上海 200031)

干细胞是组织工程与再生医学的重要种子细胞来源，但如何有效调控干细胞的定向分化，使再生组织能够满足临床应用需求，仍是组织再生领域面临的重要难题。依赖应力纤维(stress fiber，SF)传导的胞外机械刺激是调控干细胞行为的重要生理信号[1]。SF 是细胞感知环境机械刺激信号并执行细胞行为响应的重要结构，它不仅参与调控干细胞形态、黏附、迁移、增殖等多种生命活动过程，还对干细胞的干性维持及分化过程产生重要影响。由于SF可调控干细胞的诸多生物学行为，近年来已成为细胞信号转导的研究热点之一。目前已知机械刺激信号的传导过程包括整合素、黏着斑(focal adhesion，FA)、应力纤维等多级结构。其中，SF 的作用十分重要，其功能相当于信号转导过程中的“第二信使”。近几年的报道提示SF 可通过影响转录辅因子跨核分布、核膜锚定蛋白重构等方式对干细胞的分化命运进行调控，但其具体作用如何？本文将对近期这方面的研究进展作一综述。该方向研究成果不仅加深了我们对机械刺激信号调控干细胞行为机制的理解，也为寻找更高效诱导干细胞定向分化的新方法提供思路。

1 SF的动态分布与机械刺激信号密切相关

细胞通过整合素感知胞外机械信号后，在紧贴细胞膜的内侧形成FA，继而以FA 为锚定点逐步形成SF。FA 包含具有激酶活性的黏着斑激酶、黏着斑蛋白、桩蛋白等成分，可通过Ras 同源基因家族成员A(Ras homolog gene family -member A，RhoA)、细胞分裂周期蛋白42(cell division control protein 42，CDC42)等胞内信号分子共同调节SF 的动态稳定。因此，机械刺激信号显著影响细胞内SF的数量和分布范围[2]。

作为三类细胞骨架成分之一的SF 在真核细胞内普遍存在，主要由纤维状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)、Ⅱ型肌球蛋白和α-肌动蛋白构成[3]。游离态单体肌动蛋白(globular actin，G-actin)与纤维状肌动蛋白之间通过持续的聚合与解聚维持动态平衡。根据结构和功能不同，SF 分为背侧型(dorsal SF，dSF)、横向弯曲型(transverse arc，TA)和腹侧型(ventral SF，vSF)3种[4]。图1 为机械刺激促进SF形成过程的示意图。

2 SF调控干细胞分化的途径

2.1 促进MRTF-A 与SRF 结合并激活含CArG 元件的靶基因 心肌素相关转录因子A(myocardin related transcription factor-A，MRTF-A)是一类对胞外机械刺激信号敏感的转录辅激活因子，它通过RPEL 结构域与G-actin 结合，主要分布于细胞质[5]。机械刺激信号促进F-actin 组装的同时消耗细胞质内G-actin，游离状态MRTF-A 增多导致穿梭入核的数量大于出核数量，引起胞核MRTF-A 水平升高[6]。MRTF-A 在胞核与血清反应因子(serum response factor,SRF)结合之后激活含CArG 元件[CC(A/T)6GG]的靶基因(例如MyoD、PAX7 等)，可调控心肌与骨骼肌细胞发育、分化及再生[7]。间充质干细胞向平滑肌细胞定向诱导分化的过程需要MRTF-A 参与，并且肌动蛋白解聚因子DSTN 也通过减少MRTF-A 细胞核定位的方式进一步抑制平滑肌细胞的表型分化[8]。此外，在肌动蛋白及多种肌动蛋白调节因子编码基因的启动子中含有MRTF-A/SRF 复合物识别的元件，胞核MRTF-A/SRF增加后也将促进更多G-actin 表达。当G-actin 含量增多并恢复至基线水平，MRTF-A 出核回到细胞质中，从而失去转录调控活性。通过这个机制，MRTF-A 在传递机械刺激信号过程中既完成了靶基因的转录调控又维持了自身动态平衡。MRTF-A 途径详见图2。近几年研究发现，MRTF-A 的靶基因不仅调控肌肉干细胞的分化，而且参与影响其他多种干细胞的分化命运。Nobusue等[9]发现，胞核MRTF-A 水平升高不利于脂肪前体细胞向成脂方向分化，通过抑制SF 形成可将大量MRTF-A 蓄积于胞质内，从而降低胞核MRTF-A 水平并促进成脂分化。Hyväri等[10]采用小分子药物CCG-1423 或 CCG-100602 抑制人类脂肪干细胞内MRTF-A/SRF 上游启动基因的表达，也观察到脂肪干细胞向成脂方向分化增强，同时成骨分化指标碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白和骨桥蛋白均减少。以上研究结果证明MRTF-A 是调节干细胞分化方向的重要因子，胞核高水平MRTF-A 倾向于促进干细胞向成肌或成骨方向分化，胞核低水平MRTF-A 则促进干细胞向成脂方向分化。因此，SF通过控制MRTF-A 在胞核内外的分布从而对干细胞的定向分化进行调控。

图2 MRTF-A 途径示意图

2.2 促进YAP 与转录因子TEAD 结合 Yes 相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)是另一种受机械刺激和SF 介导的转录辅激活因子，参与调控多种干细胞的分化命运[11-12]。磷酸化YAP 在胞质处于无活性状态，但去磷酸化YAP 可进入胞核与转录因子TEAD 结合形成转录复合物，调控下游多种靶基因转录水平[13]。

与介导MRTF-A 入核的机制不同，SF 主要通过其收缩过程中Ⅱ型肌球蛋白的磷酸化活性强度变化来介导YAP 跨核分布。Driscoll等[14]研究发现，对间充质干细胞的动态拉伸刺激促进YAP 在胞核分布增加，采用ROCK 抑制剂干扰SF 收缩功能则无法促进YAP 入核，这些结果证实SF 收缩过程中Ⅱ型肌球蛋白的磷酸化是促进YAP 入核的关键因素。此外，Elosegui-artola等[15]发现，机械刺激信号通过SF的间接牵拉引起核孔变形提高了核孔对YAP 的亲和性和扩散能力，因此转运入核的YAP 数量显著上升。图3 为YAP 途径示意图。

图3 YAP 途径示意图

近期研究表明，机械刺激介导的细胞核YAP 水平升高会抑制间充质干细胞的成脂分化，并且促进成骨分化或成肌分化[16]。Totaro等[17]还发现，SF 活性下降引起胞核YAP 减少时将导致Notch 信号通路增强，从而促进表皮干细胞分化，较高水平的胞核YAP 有助于维持表皮干细胞的干性。由此可见，SF通过Ⅱ型肌球蛋白磷酸化活性及核孔开放性变化介导YAP 在细胞核定位增加，通过形成TEAD 转录复合物对干细胞分化过程进行调控。

2.3 促进核膜LINC 复合物介导核外周染色质开放性增加 细胞核骨架与细胞骨架连接复合物(linken of nucleoskeleton and cytoskeleton，LINC 复 合 物)是由外层核膜Nesprin 蛋白及内层核膜SUN 蛋白共同组成的核膜结构，Nesprin 蛋白的N 末端与细胞骨架相连，C 末端KASH 结构域与SUN 蛋白结合。Nesprin 蛋白具有不同亚型：Nesprin-1、Nesprin-2 与F-actin 结合，Nesprin-3、Nesprin-4 分别与中间丝和微管结合[18]。LINC 复合物的主要作用是通过物理连接将细胞外环境机械刺激信号由SF 传递至核膜内侧的核纤层，它可以精确感知SF 的机械力学强度并对自身结构进行适应性调节[19]。Arsenovic等[20]将编码Nesprin-2G 蛋白的基因进行编辑改造，使其增加表达具有荧光共振能量转移功能的基因片段。改造后的Nesprin-2G 蛋白具有类似张力传感器的功能，该研究通过核膜的荧光强度精准检测了SF 作用于核膜的机械力大小以及空间分布特征。因此，LINC 复合物是核膜上承载机械刺激信号的重要结构，并且其承载的力学强度由SF 收缩活性和细胞变形程度共同决定。

机械刺激信号持续存在时SF 数量将随之增加，引起LINC 复合物及核纤层蛋白的数量相应增加。这种动态变化将通过核纤层相关染色质结构域(lamina-associated domain,LAD)的牵引作用促进LAD 毗邻区域染色质空间开放程度提高，以促进该区域分化相关基因转录水平升高。图4 为LINC 复合物途径示意图。

图4 LINC 复合物途径示意图

LINC 复合物的功能异常会损害机械刺激信号对干细胞分化的调控作用。David等[21]在小鼠胚胎干细胞中证实Nesprin 蛋白的功能重要性。作者运用基因编辑技术使Nesprin-1 和Nesprin-2 蛋白的KASH 结构域缺失，当过表达这些异常Nesprin 蛋白时SF 无法与胞核进行机械信号传导，其结果显示胚胎干细胞分化程度显著降低。Carley等[22]也通过实验证明LINC 复合物是机械张力维持表皮干细胞干性的必要结构，破坏LINC 复合物将引起机械张力下降并导致表皮干细胞启动分化。该研究还发现，表皮干细胞的分化程度与LINC 复合物承载的张力强度具有相关性。尽管现有的研究已明确LINC 复合物参与干细胞分化调控，但其主要作用是提高核外周染色质的空间开放性，促进相关转录调控因子更好地与分化相关靶基因结合。

2.4 促进Emerin 蛋白介导Ezh2 酶移位 Emerin 蛋白是广泛分布于核膜的一种结构成分，在内层和外层核膜均有分布。定位于内层核膜的Emerin 蛋白与核纤层接触，它对干细胞分化的调控机制与LINC复合物有所不同。Ma等[23]在C2C12 成肌细胞中的研究显示，内层核膜Emerin 蛋白通过锚定肌源性特异分化抑制因子MSX1 的方式将组蛋白甲基转移酶Ezh2 富集在核外周区域，促使该区域促成肌分化关键转录因子基因维持高水平H3K27me3 修饰，导致表达受抑制。当内层核膜Emerin 蛋白缺乏时，Ezh2和H3K27me3 向核中央区域转位，对核外周区域促分化相关基因转录的抑制程度降低，C2C12 细胞启动分化过程。该研究揭示了Emerin 蛋白调控成肌细胞的分化机制，也可看出Emerin 蛋白在内、外层核膜的空间分布变化将影响其对基因的调控效果。图5 为Emerin 蛋白途径示意图。

图5 Emerin 蛋白途径示意图

近期研究[24]发现，SF 会引起Emerin 蛋白在内层核膜的分布减少。SF 数量及收缩活性增加将引起核膜表面Src 激酶磷酸化水平升高，进而促进内层核膜Emerin 蛋白发生磷酸化并向外层核膜转移。与此同时，内层核膜Emerin 蛋白数量的减少导致Ezh2 酶无法继续附着定位于核外周区域，因此该区域基因H3K27me3 修饰程度降低，基因转录活性升高。需要注意的是，机械刺激引起核外周基因转录增加具有调节干细胞分化的作用，但其分化方向则取决于具体的干细胞类型。例如，机械刺激增加有助于维持表皮干细胞的未分化状态，但在肌肉干细胞中的效果则相反[23-24]。以上研究初步揭示了SF 通过Emerin 蛋白途径对干细胞分化进行调控的机制，该过程主要通过Ezh2 酶在核内移位引起分化相关基因H3K27me3 修饰水平的变化完成。

3 总结及展望

由于SF 对细胞调控的途径多，对细胞生物学行为的影响也是多方面的。不同的调控途径会产生不同的细胞行为改变。通过深入探讨SF 调控干细胞分化的不同分子机制，探索利用SF 信号相关的下游关键分子来调控细胞行为，其靶向性更明确，理论上可获得更精确的调控效果。但SF 参与基因表达的生物力学调节机制可能还涉及对细胞核骨架和染色质空间构象的调控，目前我们对该领域仍知之甚少[25]。借助新型染色质空间成像技术对干细胞染色质空间构象变化规律进行分析，可能有助于进一步理解SF调控干细胞分化的作用过程[26]。此外，机械刺激信号介导干细胞分化调控还可能与多种表观修饰酶驱动的染色质重塑密切相关，进一步破译这些表观修饰“密码”有望揭示更全面的作用机制[27-28]。总之，该领域研究的推进将帮助我们寻找更加精确有效的手段对干细胞分化进行调控。