桂枝去桂加茯苓白术汤含药血清对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞EMT的抑制作用及其机制

孙妍，李清初 ，，谷翠芝，葛汝村 ，孟凡华，毕慧欣

1 山东省立第三医院肾内科，济南 250031；2 桂林医学院附属医院肾内科

急性肾损伤（AKI）是临床较为常见的一种急危重症。AKI 大多发展为慢性肾脏病，甚至进展至终末期肾病，但目前尚无特异性治疗措施，寻求新的治疗靶点是当前亟需解决的问题。肾间质纤维化是急性肾损伤发展为慢性肾脏病的关键环节，而肾小管上皮—间充质转化（EMT）是肾间质纤维化发生的关键机制［1-2］。EMT 是指在特定条件下上皮细胞转化为间充质细胞的生物学过程。与EMT 发生相关的通路有很多，其中转化生长因子β1（TGF-β1）/细胞因子Smad 信号转导途径是最为强烈的致肾小管细胞EMT 的信号通路［3］。除 Smad 通路外，TGF-β1还可通过各种非Smad依赖途径诱导EMT，包括丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途径［4］。中医药在防治小管间质损害、延缓慢性肾功能衰竭方面具有一定的临床疗效。桂枝去桂加茯苓白术汤是辛温解肌、健脾利水的代表方，主治太阳中风证或脾虚水气证。临床研究显示，桂枝去桂加茯苓白术汤治疗AKI 可显著改善患者的肾功能［5-6］。但其作用机制是否与肾小管上皮细胞EMT 和肾间质纤维化有关目前尚不清楚。2019 年 12 月—2020 年 10 月，我们使用 TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞EMT，观察桂枝去桂加茯苓白术汤对 TGF-β1/Smad3 及 TGF-β1/MAPK 信号通路活性的影响，并探讨其作用机制，为该方剂防治肾纤维化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞 SPF 级8 周龄雄性SD 大鼠40只，购自济南朋悦实验动物技术有限公司。饲养于山东省立第三医院动物实验室。动物在光暗周期为12 h/12 h环境中适应性喂养5 d，自由进食进水。人肾小管上皮细胞HK-2 购自武汉普诺赛生命科技有限公司（美国ATCC细胞库）。

1.1.2 药物与试剂 桂枝去桂加茯苓白术汤的方药组成为芍药15 g、甘草10 g、生姜15 g、白术15 g、茯苓15 g、大枣20 g，药物购自山东省立第三医院。称取中药，加水500 mL，浸泡30 min 后煎煮45 min，过滤去渣，把过滤后的药汁在100 ℃恒温干燥箱中蒸发浓缩至100 mL，含生药0.9 g/mL，装瓶密封，置4 ℃冰箱保存备用。MEM 细胞培养基、胎牛血清、双抗及胰蛋白酶购自美国Hyclone 公司；MTT 试剂盒购自北京索莱宝公司；GAPDH、E钙黏蛋白（E-cadherin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（Vimintin）、Smad3、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、p38、JNK 单克隆抗体以及磷酸化抗体p-Smad3、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK 抗体均购自英国Abcam 公司。

1.1.3 主要仪器 CO2细胞培养箱（美国Thermo 公司），荧光倒置显微镜（日本奥林巴斯公司），稳压稳流电泳仪（美国BIO-RAD公司）。

1.2 大鼠含药血清制备 将大鼠分为低剂量组、中剂量组、高剂量组和空白对照组各10只，根据“人和动物间体表面积折算的等效剂量比率表”进行换算，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予桂枝去桂加茯苓白术汤5、10、20 g/（kg·d）灌胃，正常对照组给予等体积生理盐水灌胃。每日1 次，连续7 d。末次灌胃 1 h 后腹主动脉采血，4 ℃、3 000 r/min 离心20 min，取上清。56 ℃水浴箱灭活30 min，0.22 µm滤膜过滤除菌，-80 ℃冰箱保存。

1.3 细胞培养 将HK-2 细胞加入含10% FBS 的MEM 培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞贴壁生长至80%左右时进行分组并干预。

1.4 细胞分组与干预 取HK-2 细胞，以1×105/孔接种于6孔板中。将细胞分为5组，空白对照组加入空白对照组大鼠血清；TGF-β1组加入5 ng/mL TGF-β1；低浓度含药血清干预组加入低剂量组大鼠含药血清后，再加入5 ng/mL TGF-β1；中浓度含药血清干预组加入中剂量组大鼠含药血清后，再加入5 ng/mL TGF-β1；高浓度含药血清干预组加入高剂量组大鼠含药血清后，再加入5 ng/mL TGF-β1。各组均培养48 h。

1.5 细胞中EMT 标志蛋白、MAPK 信号通路蛋白、Smad3 信号通路蛋白表达检测 采用Western blotting 法检测细胞中EMT 标志蛋白E-cadherin、α-SMA、Vimintin 蛋白表达，MAPK 信号通路相关蛋白 ERK1/2、p38、JNK 磷酸化水平，Smad3 信号通路蛋白Smad3 磷酸化水平。收集各组细胞，提取细胞总蛋白，于98 ℃金属浴加热10 min 进行蛋白变性，使用BCA 蛋白测定试剂盒进行蛋白定量。经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、5%BSA-TBST 封 闭 后 ，分 别 加 入 1∶5 000 稀 释 的GAPDH 及 1∶1 000 稀释的一抗，4 ℃摇床过夜。辣根过氧化物酶标志的二抗检测杂交蛋白，ECL超敏发光液进行化学发光扫描成像。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达 量 ，以 p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、p-Smad3 与ERK1/2、p38、JNK、Smad3 的比值代表 ERK1/2、p38、JNK、Smad3 蛋白磷酸化水平。

1.6 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞EMT 标志蛋白表达水平比较 见表1。

表1 各组细胞EMT标志蛋白表达水平比较（）

表1 各组细胞EMT标志蛋白表达水平比较（）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与TGF-β1组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

Vimintin 1.00±0.03 1.13±0.04*0.96±0.09#0.82±0.15#0.78±0.09##组别空白对照组TGF-β1组低浓度含药血清干预组中浓度含药血清干预组高浓度含药血清干预组E-cadherin 1.00±0.10 0.35±0.09**0.50±0.02 0.59±0.05#1.14±0.05##α-SMA 1.00±0.14 4.73±0.22**4.41±0.17 2.83±0.40##2.59±0.21##

2.2 各组细胞MAPK、Smad3 通路蛋白磷酸化水平比较 见表2。

表2 各组细胞MAPK、Smad3通路蛋白磷酸化水平比较（）

表2 各组细胞MAPK、Smad3通路蛋白磷酸化水平比较（）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与TGF-β1组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别空白对照组TGF-β1组低浓度含药血清干预组中浓度含药血清干预组高浓度含药血清干预组Smad3 1.00±0.08 2.17±0.19**2.26±0.26 1.66±0.12#1.33±0.14##ERK1/2 1.00±0.07 2.14±0.42*1.39±0.14 1.41±0.19 1.18±0.07#JNK 1.00±0.06 1.78±0.33*1.08±0.23 0.95±0.07#0.64±0.05##p38 1.00±0.08 1.50±0.19*0.99±0.11#0.84±0.10#0.75±0.06##

3 讨论

AKI 是临床常见的急危重症，除具有较高的死亡风险外，其远期预后也不容乐观，常进展为慢性肾脏病甚至终末期肾脏疾病［5］。与未发生AKI 的人群相比，AKI 患者发生CKD 的风险升高约 8 倍，发生ESRD 的风险升高约 3 倍［6］。动物实验显示，肾小管EMT 是AKI 进展至CKD 肾脏间质纤维化的重要发病机制之一［7-8］。AKI 发生后，当损伤较重或损伤持续存在时，肾小管上皮细胞不能完成正常的增殖分化进行自我修复，而是发生过度活化而转分化为肌成纤维细胞，持续分泌炎症因子和促纤维化因子，引起慢性肾小管—间质炎症反应和纤维化，促使AKI向 CKD 转化［9］。抑制 EMT 进程对延缓或阻止 AKI向CKD 转化具有重要意义。桂枝去桂加茯苓白术汤是中医经典方剂，证见于《伤寒论》“服桂枝汤，或下之，仍头项强痛，翕翕发热，无汗，心下满，微痛，小便不利者，桂枝去桂加茯苓白术汤主之”。我们的前期研究表明，桂枝去桂加茯苓白术汤用于治疗AKI疗效满意，1 周内患者尿素氮、肌酐、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、肾损伤因子1明显降低，肾功能快速恢复［10-11］。在脓毒血症性AKI 大鼠中，桂枝去桂加茯苓白术汤可抑制NF-κB、TNF-α 信号通路，通过抑制炎性因子分泌，抑制脓毒症对肾组织的损伤，从而抑制 AKI 发展至 CKD［12］。但在 AKI 进展至CKD 过程中，桂枝去桂加茯苓白术汤能否抑制EMT进而延缓CKD的进展尚未可知。

EMT 是指细胞黏附分子（如E-cadherin）和上皮分化标志物（如细胞角蛋白）的丢失，以及间质标志物（如N-cadherin、Vimentin 和α-SMA）的上调。本研究利用 TGF-β1诱导 HK-2 细胞建立 EMT 模型，在肾小管上皮细胞EMT 发生过程中，上皮细胞标志蛋白E-cadherin 表达显著减低、间质细胞标志蛋白α-SMA、Vimintin 表达升高，提示肾小管上皮细胞EMT 造模成功。经过不同剂量桂枝去桂加茯苓白术汤含药血清干预后，细胞中E-cadherin 蛋白表达明显升高，α-SMA、Vimintin 表达明显降低，这种效应在高浓度组中更显著，提示桂枝去桂加茯苓白术汤能够抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT 的发生。

EMT 过程中，由TGF-β1诱导间质基质产生肌成纤维细胞中发挥显著作用。TGF-β1信号通过多种Smad 和非 Smad 信号途径传递，其中 Smad3 是 Smad依赖信号通路中最为关键的下游因子，而MAPK 信号通路则是TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT 的重要非 Smad 依赖信号通路之一［13］。TGF-β1/Smad3 信号通路在AKI 转归中起重要作用，表现为Smad3 的过度活化，基因敲除Smad3 可以显著抑制缺血所致肾功能丢失，减轻肾小管坏死以及炎性反应因子的分泌［14］。在不同病因所引起的肾纤维化模型中，敲除Smad3基因可以明显缓解肾纤维化程度和Ⅰ型胶原蛋白的表达［15］。因此，持续活化TGF-β1/Smad3信号通路不仅加剧AKI 的病情，还促进AKI 向CKD 的转化。本研究结果显示，不同浓度桂枝去桂加茯苓白术汤含药血清能明显降低TGF-β1诱导的HK-2 细胞内Smad3 蛋白磷酸化水平，且高浓度组效果更为明显。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径即ERK1/2、JNK 和 p38 MAPK 调控 EMT［16］。研究证实，对 ERK或p38 MAPK 通路的抑制能显著削弱细胞的表型转化［4］。在大鼠单侧输尿管梗阻模型及TGF-β1刺激下的肾小管上皮细胞中通过抑制JNK MAPK 通路可以实现对肾小管EMT 及肾纤维化的部分逆转［16］。本研究结果显示，给予 TGF-β1诱导 HK-2 细胞 48 h 后，ERK1/2、JNK 和 p38 蛋白磷酸化水平显著上调；给予不同浓度桂枝去桂加茯苓白术汤含药血清干预HK-2 细胞后，ERK1/2、JNK 和 p38 蛋白磷酸化水平均下调，且对JNK 和p38 蛋白磷酸化水平下调更显著。

综上所述，桂枝去桂加茯苓白术汤能显著抑制TGF-β1诱导的 HK-2 细胞 EMT 过程，其作用机制可能与其抑制 TGF-β1/Smad3、TGF-β1/MAPK 信号通路的激活有关。