高效液相色谱-电雾式检测器法测定尿素乳膏含量

2022-09-22 08:24柳冬梅赵慧
安徽医药 2022年10期
关键词:液相色谱仪量瓶乳膏

柳冬梅,赵慧

尿素是一种极性小分子,由二氧化碳和液氮经化学反应后脱水而制得,又称为碳酰胺或脲,具有较强的末端紫外吸收[1]。

泰州市中医院的尿素乳膏质量标准和2015年版《中华人民共和国药典》(以下简称中国药典)均采用显色后紫外-可见分光光度法,具有重现性差,操作繁琐及不适合批量分析等问题[2]。因此,有必要开发一种新方法用于测定尿素乳膏的含量,解决现有标准方法的可操作性及重现性等问题。查阅文献发现目前尿素乳膏的测定方法主要有电位滴定法,紫外-可见分光光度法及高效液相色谱法(HPLC)[3-5]。其中HPLC大多选用氨基柱和紫外检测器进行测定,存在灵敏度低,色谱柱消耗大,检测成本高等问题[6-8]。电雾式检测器(CAD)响应信号依赖于被测物的绝对质量,可用于分析各种半挥发性或不挥发性的酸性、碱性、中性、非极性及极性的两性离子[9-19]。

本研究起止时间为2019年5月至2020年3月,通过建立HPLC-CAD法测定尿素乳膏的含量,新建的方法具有操作简单,准确性好,灵敏度高,专属性强等特点,可为尿素乳膏的质量控制提供新方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药高效液相色谱仪(型号UltiMate 3000,美国Thermo Fisher Scientific公司)、CAD(型号CoronaVeo SD,美国Thermo Fisher Scientific公司),电子天平(型号XPR-225,瑞士Mettler公司)

15%的尿素乳膏(泰州市中医院,批号20190125、20181220、20181101,规格15%);尿素对照品(中国食品药品检定研究院,批号100288-201302);乙腈(色谱纯,Merck公司);乙醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);实验用水均由Milli-Q纯水系统制备。

1.2 方法与结果

1.2.1 色谱条件 采用Waters XBridge Amide酰胺色谱柱(4.6 mm×250 mm,3.5 μm);水-乙腈(10∶90)为流动相;柱温为35℃;流速为1.0 mL/min;进样量为10 μL;CAD参数设置:雾化温度为35℃,幂率为0.9,过滤常数为10 s,采集频率为10 Hz。

1.2.2 溶液制备 精密称取尿素对照品25 mg,置量瓶中,加乙醇适量,超声使其完全溶解后,用乙醇稀释使成浓度为每毫升中约含1 mg尿素的溶液,摇匀,作为储备液。

精密量取储备液适量,分别用乙醇定量稀释制成浓度为每毫升中约含0.5 mg、0.2 mg、0.1 mg、0.05 mg、0.02 mg、0.01 mg及0.005 mg尿素的溶液,作为系列浓度的标准曲线溶液。

称取尿素乳膏样品约1.3 g(约相当于尿素200 mg),精密称定,置100 mL量瓶中,加乙醇适量,于60℃的水浴中加热20 min使其完全溶解后,冷却至室温,用乙醇定容,摇匀,置冰浴中冷却,滤过,弃去初滤液;精密量取续滤液10 mL,置100 mL量瓶中,用乙醇定容,摇匀,作为供试品溶液。

精密量取储备液10 mL,置50 mL量瓶中,加乙醇定容,摇匀,作为对照品溶液。

根据泰州市中医院尿素乳膏的配方制备空白基质,精密称取空白基质1.3 g,置100 mL量瓶中,按照供试品溶液配制的方法,同法制备空白溶液。

1.2.3 系统适用性试验与破坏性试验 分别精密吸取空白溶液,尿素对照品溶液及尿素乳膏供试品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图(图1),结果表明,溶剂对尿素主峰无干扰,尿素乳膏基质中的辅料及其他成分对测定无干扰,理论塔板数按尿素色谱峰计算大于15 000。

图1 空白溶液(A)、供试品溶液(B)、对照品溶液(C)的高效液相色谱图

精密称取尿素对照品10 mg,5份,分别置20 mL量瓶中,加乙醇适量使其完全溶解,分别经过碱(0.1 mol/mL氢氧化钠)破坏,酸(0.1 mol/mL盐酸)破坏,光照(4 500 lx)破坏,氧化(30%过氧化氢)破坏及高温(水浴加热)破坏后,得到相应的破坏性溶液。

精密量取破坏溶液各10 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图(图2)。结果表明,各破坏条件下产生的杂质峰对测定均无干扰,表明新建的方法分离效果好,专属性强。

图2 破坏性试验色谱图

1.2.4 线性与范围 精密吸取“1.2.2”项下系列标准曲线溶液各10 μL,依次注入液相色谱仪,进样分析并记录各色谱图。以尿素色谱峰峰面积(Y)作为纵坐标,浓度(X)作为横坐标,绘制线性标准曲线,线性回归方程:Y=2712X-13.726,r=0.999。结果表明尿素在0.005~0.5 g/L的浓度范围内呈现良好的线性关系。

1.2.5 进样精密度与重复性 精密吸取同一对照品溶液,连续进样6次进行测定。6次测定的主峰峰面积的相对标准差(RSD)为0.52%(n=6),结果表明该液相色谱仪的进样精密度良好。

分别精密称取尿素乳膏样品(批号20181220)6份,制备相应的供试品溶液,进样分析,测定尿素乳膏的含量。结果尿素含量为标示量的97.9%(n=6),RSD为0.91%(n=6),表明该方法的重复性良好。

1.2.6 定量限(LOQ)和检测限(LOD) 将“1.2.2”项下最低浓度的标准曲线溶液逐级稀释,并依次进样测定。按信噪比(S/N)=10计算,该方法测定尿素的定量限为5 ng;按S/N=3计算,该方法测定尿素的检测限为2.5 ng。

1.2.7 溶液的稳定性 取同一份尿素乳膏供试品溶液(批号20181220),分别在0 h、4 h、8 h和12 h进样分析,记录色谱图。结果主峰峰面积的RSD为0.53%。结果表明,供试品溶液在12 h内保持稳定。

1.2.8 回收率试验 称取空白基质各6份,精密称定,分别置100 mL量瓶中,再依次精密加入尿素对照品适量,制备6份供试品溶液。依次进样分析,计算回收率,见表1。

表1 回收率结果

1.2.9 耐用性 调节流动相中乙腈和水的比例,柱温及流速等参数,考察尿素色谱主峰的理论塔板数,对称因子及其与各杂质峰之间的分离情况。结果表明,尿素色谱峰的对称因子均小于1.2,且杂质对尿素测定无干扰,结果表明该方法耐用性良好。

1.2.10 样品测定 分别称取尿素乳膏样品和尿素对照品适量,制备尿素乳膏供试品溶液与对照品溶液,每批样品分别制备2份供试品溶液,每份分别进样2次,按外标法以峰面积计算尿素标示量的百分含量,批号20181101、20181220、20190125的三批次样品检测含量分别为95.6%、98.0%、92.5%,对应的RSD分别为0.38%、1.20%、0.41%。

2 讨论

2.1 色谱柱的选择本研究采用酰胺色谱柱进行尿素乳膏的研究分析。XBridge Amide色谱柱使用稳定的三键键合式的酰胺官能团作为键合相,其选择性与氨基柱相近,但是化学性质更加稳定,因此该色谱柱耐受性更强,稳定性更高,寿命更长,更适合于极性物质的分析[20]。

2.2 CAD的相关参数设置CAD影响信号响应的参数主要有三类:①采集频率和过滤常数。通过试验研究发现,采集频率和过滤常数的增大,色谱图中基线波动越小,同时色谱峰的平滑度也越好,通过试验比较最终设置采集频率和过滤常数分别为10 Hz和10 s。②雾化温度。CAD主要通过加热进行雾化,且待测物的信号响应与其雾化程度息息相关,因此试验分别考察55℃和35℃两种不同雾化温度对信号响应的影响。结果发现随着雾化温度的升高,尿素色谱峰的响应明显降低,不利于尿素的检测,最终选用35℃的雾化温度。③幂率。幂率是CAD特有的线性校正参数,不同类型的化合物具有不同的最优幂率,实验考察不同的幂率(0.8、0.9、1.0、1.1)对线性的影响,结果见表2。研究发现幂率为0.9时,尿素在0.005~0.500 g/L范围内的线性关系最佳。

表2 幂率(PFV)参数优化

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