CD47单克隆抗体对输血相容性检测的干扰及配血策略

刘鸿雁，蒋姝婷，朱伟彦，燕备战，史景莉

(河南省人民医院/郑州大学人民医院 输血科，河南 郑州 477150)

CD47是一种在多类恶性肿瘤细胞表面高表达的糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，又被称作整联蛋白相关蛋白[1]。研究表明CD47可以通过与巨噬细胞上的信号调节蛋白α(signal-regulatory protein alpha，SIRPα)结合形成“Don’t eat me”信号，抑制吞噬细胞对肿瘤细胞的吞噬功能，进而使肿瘤逃逸机体的免疫监视与攻击[2-3]。针对这一发现，CD47单克隆抗体的应用可以有效与肿瘤细胞表面的CD47相结合，阻断CD47-SIRPα信号通路的形成，促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬和清除，从而成为治疗多种血液系统肿瘤以及实体肿瘤的新方法[4-5]。但CD47不仅存在于恶性肿瘤细胞表面，同样广泛表达于其他细胞型，CD47单克隆抗体的弊端是引起血细胞的凝集，有研究表明CD47单克隆抗体的应用会干扰输血前的血清学检测，影响输血策略的制定，存在误判风险，导致溶血性输血反应的发生[6-7]。目前国内对CD47单克隆抗体影响输血相容性检测的干扰处理经验尚少，本研究针对信达生物中和试剂进行病案讨论。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2021年8—12月在河南省人民医院血液科接受CD47单克隆抗体药物IBI188(信达生物)联合阿扎胞苷治疗3例骨髓异常综合征患者。Zubrod-ECOG-WHO(ZPS，5分法)评分小于2分，各项检查均符合药物入组条件。本研究符合赫尔辛基宣言，通过河南省人民医院医学伦理委员会批准(批件号2020-060)，患者签署知情同意书。

1.2 CD47单克隆抗体用药方法IBI188从低浓度逐渐上升至高浓度，用药浓度依次为0.1、0.3、1.0、1.0、15.0 mg·kg-1(低浓度)，第6次用药浓度为30.0 mg·kg-1(高浓度)，后续维持该剂量。低浓度用药每3～4 d进行1次，结束1周后进行高浓度用药，高浓度用药每周1次。用药频次均在患者各项指标允许的情况下执行，如有特殊情况则适当顺延。

1.3 试剂和设备ABO血型正反定型试剂(长春博讯，批号20210714、20210903、20211011、20211126)；正反定型血型卡(达亚美，批号50093.91.39)；不规则抗体筛查细胞(长春博迅，批号20210601、20210817)；微柱凝胶卡(长春博迅，批号20210306)；抗人球蛋白试剂(上海血液中心，批号：20210720)；改良凝聚胺试剂(中山生科，批号20210615)；血清学离心机(中科中佳)；卡式离心机(长春博研)，中和试剂(信达生物实验用试剂)。

1.4 检测方法(1)ABO血型及RhD血型鉴定：分别用试管法和卡式法鉴定红细胞和血浆。(2)不规则抗体筛查：将抗筛细胞稀释后分别用试管法和卡式法筛查。(3)直接抗人球蛋白试验：将患者红细胞稀释后分别用试管法和卡式法检测。(4)交叉配血：凝聚胺试剂试管法交叉配血，抗人球蛋白卡做卡式法交叉配血。(5)中和试剂处理：中和试剂3 000 r·min-1离心2 min，加入100 μL患者血浆，室温静置2 min后进行试验。

1.5 观察指标(1)记录患者未用药和用药后血型、不规则抗体、直接抗人球蛋白试验、交叉配血试验的结果。(2)监测患者输注红细胞后血红蛋白的变化。(3)对照患者输血前后总胆红素和间接胆红素的改变。

2 结果

2.1 患者信息(1)患者甲，男，27岁，AB型血，因确诊骨髓增生异常综合征2个月余入院，确诊后曾接受口服环孢素、左旋咪唑、达那唑等保守治疗，于2021年10、11月接受IBI188治疗，后因骨髓穿刺疗效评估病情未缓解，退出治疗组。(2)患者乙，女，72岁，A型血，确诊骨髓增生异常综合征5个月余，于2021年9、10、11、12月接受IBI188治疗。(3)患者丙，男，36岁，血型O型，确诊骨髓增生异常综合征5个月余，于2021年9、10、11、12月接受IBI188治疗，后因肛周脓肿合并其他感染退出治疗组。

2.2 不同剂量用药对患者血型的影响患者在未使用药物及接受低剂量药物治疗时，血型鉴定未受到影响，但高剂量用药时非O型血患者出现正反定型不相符，O型血患者出现O细胞凝集。见表1。

表1 不同剂量治疗后对患者血型的影响

2.3 不同剂量用药对患者直接抗人球蛋白试验、不规则抗体以及交叉配血的影响患者在未使用药物及接受低剂量用药治疗时对直接抗人球蛋白试验、不规则抗体和交叉配血没有影响，但高剂量用药对试验产生影响。见表2。

表2 不同剂量治疗后患者直接抗人球蛋白试验、不规则抗体以及交叉配血的变化

2.4 高剂量用药对患者血红蛋白和胆红素的影响患者第6次用药24 h后不规则抗体阳性，卡式法交叉配血不相合，使用中和试剂中和血清中的CD47单克隆抗体，再用卡式法交叉配血，患者的血红蛋白水平提升。患者甲第8次治疗后出组。患者乙第10次用药后病情好转，血红蛋白一直维持在90 g·L-1左右，未再输血。患者丙第9次治疗后出组。输血后患者的24 h血红蛋白和胆红素的变化见表3。

表3 高剂量药物治疗后24 h患者血红蛋白和胆红素变化

3 讨论

随着对肿瘤细胞表面物质的深入研究，单抗类药物正越来越广泛地应用于肿瘤及其他难治性疾病的治疗中，这些单抗类药物根据不同的作用位点和作用机制，对输血等实验室相关检测的干扰也越来越多地引起大家关注，任何会对红细胞表面抗原发生反应的单抗类药物均可能会干扰输血相关性检测等。其中，CD38单克隆抗体近年来对输血相容性检测试验的干扰已引起输血领域的广泛关注。目前国内CD47单克隆抗体药物的应用案例较少，对于处理CD47单克隆抗体对输血相容性检测干扰的经验尚浅。

不同于CD38在红细胞表面的低表达，CD47是一种广泛表达于人类细胞表面的跨膜蛋白，其在红细胞表面表达较高[8]，本文通过对3例受试者的分析发现，在入组用药治疗前患者的血型结果正反定型相符，不规则抗体筛查阴性，治疗后高剂量的CD47单克隆抗体药物引起抗人球蛋白试验阳性，患者血浆中残留的CD47单克隆抗体与反定型试剂相结合，干扰血型反定型结果也会与筛检细胞结合从而导致不规则抗体筛查试验阳性，CD47单克隆抗体的应用不仅影响交叉配血的结果，同时存在有临床意义的血型抗体被掩盖的风险，导致后续输血过程中出现溶血性输血反应。

CD47单克隆抗体属于IgG4型，使用盐水法时，凝聚胺法和卡式法交叉配血会出现3+～4+的凝集，不仅影响交叉配血的结果，同时存在有临床意义的血型抗体被掩盖的风险。本研究对患者应用中和试剂(IBI188)，高特异性中和试剂通过与血浆中残留的CD47单克隆抗体结合，阻止CD47单克隆抗体与红细胞表面结合带来的干扰，中和试剂处理后再进行血型反定型鉴定、不规则抗体筛查以及交叉配血，正反定型相符，不规则抗体筛查阴性，交叉配血主次侧均相合，红细胞发放后对患者进行跟踪，并对比患者的血红蛋白和溶血项检查。患者甲输注红细胞后血红蛋白水平提升，但总胆红素和间接胆红素水平也升高，溶血的原因与药物相关，可能是因为红细胞上的CD47表达一种阻止程序性细胞凋亡的机制。红细胞可能会表达“eat me”信号，使它们更容易被肝和脾中的巨噬细胞消除，因此尝试给予小剂量的CD47单克隆抗体，先消灭相对老化的红细胞，并刺激新红细胞生成。大剂量治疗期间，新产生的红细胞和输注的红细胞不会受到影响。患者甲第8次治疗后由于出现严重的感染，不再接受后续治疗。患者乙在治疗过程中未出现明显的溶血现象，第10次用药后病情好转，持续用药到疗程结束，血红蛋白一直维持在90 g·L-1左右，未再输血。患者丙的红细胞输注效果也很理想，未出现明显的溶血，9次治疗后间接胆红素升高，患者因合并肛周脓肿等其他疾病，停止用药。

不同于CD38单克隆抗体的干扰可以被0.2 M二硫苏糖醇消除，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α抗胰蛋白酶、二巯基乙醇、温自身抗体去除试剂、乙二胺四乙酸甘氨酸(去除覆盖在红细胞上的IgG)均无法消除CD47单克隆抗体的干扰[6-9]。本研究通过对比CD38单克隆抗体与CD47单克隆抗体的不同，结合临床经验，分析CD47单克隆抗体对输血相容性检测的干扰及其处理措施。考虑到CD47单克隆抗体可以与红细胞及血小板结合的特性，可以采用未结合有相应抗体的同种异体红细胞或血小板对CD47单克隆抗体进行吸附。研究显示，CD47抗原在不同Rh分型细胞中表达有差异[10-12]。莫春妍等[6]采用CD47抗原表达量高的Rh分型ccdee红细胞吸收患者血浆中抗CD47单克隆抗体可以有效去除CD47单克隆抗体对输血相容性检测的干扰，该团队同样采用了血小板吸收方法，该方法相较于红细胞吸收，可去除部分CD47单克隆抗体干扰，但是无论是红细胞吸收还是血小板吸收均有操作费时费力的弊端，无法作为输血科工作的首选。

正在进行的以CD47为靶点的临床试验药物主要有：Forty Seven公司的人源化抗CD47单抗Hu5F9-G4，Trillium Therapeutics公司的SIRPα-Fc融合蛋白TTI-621，恒瑞医药的抗CD47单抗SHR1603，信达生物的抗CD47单抗IBI188，宜明昂科的SIRPα-Fc融合蛋白及双特异性抗体IMM01。药物抗体类型不同，处理方法也不同，Hu5F9-G4使用缺乏IgG4的抗球蛋白试剂，SHR1603和IBI188使用相应公司的中和试剂，SIRPα-Fc融合蛋白及双特异性抗体的IMM01的影响相对弱一点[13]。斯坦福大学的研究指出单抗药物Hu5F9-G4联用利妥昔单抗治疗霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的缓解率明显提高[14]。罗宜洋等[15]研究发现SIRPα-Fc融合蛋白TTI-621在治疗血液肿瘤与红细胞结合很少，引起轻度的贫血，这对血液肿瘤患者来说是福音。宋婕等[16]的研究中指出抗CD47单克隆抗体药物IBI188治疗的患者，输注红细胞安全有效。随着药物的不断研发，CD47单克隆抗体对输血相容性检测的影响会逐渐增加。本研究3例患者在入组用药治疗之前患者的血型结果正反定型相符，不规则抗体筛查阴性，凝聚胺法交叉配血和抗人球卡式配血主次侧均相合。但是入组治疗用药后均出现血型正反定型不一致，不规则抗体筛查阳性，凝聚胺和抗人球卡式交叉配血不相合，这也证明CD47单克隆抗体的干扰不是偶发现象。反复繁琐的验证试验包括在CD38单克隆抗体中常用二巯基乙醇、二硫苏糖醇、木瓜蛋白酶等进行处理，均不能排除干扰，通过查阅患者病历，查看用药记录，与临床医生进行沟通后发现用药为CD47单抗，此类药物未上市，正在临床试验阶段，对此类药物的了解不够深入，因此应对措施也欠缺。

根据本病例并参考相关文献得到以下启示。(1)加强临床沟通：临床医生应在CD47单克隆抗体治疗前联系输血科，了解CD47单克隆抗体的抗体类型。(2)完善治疗前检测：在CD47单克隆抗体治疗前尽可能地完善输血相容性检测，包括血型鉴定、不规则抗体筛查、Rh血型分型，不规则抗体阳性需要进行相应抗体的鉴定，试验条件允许的情况下还需要对Kidd、Duffy等其他血型系统抗原进行鉴定，如果有条件可以增加血型的基因型检测，或者在药物治疗前留取血浆标本。(3)无相应试剂时，可以考虑采用同种异体红细胞或血小板对CD47单克隆抗体进行吸附。(4)如果无法吸收抗体以及同种抗体难以排除，建议输注基因型一致的红细胞。