一种基于ESIPT原理的反应型半胱氨酸荧光探针的合成及细胞成像研究*

曹小燕，张 强，任传清

(陕西理工大学,陕西省催化基础与应用重点实验室，陕西 汉中 723000)

生物硫醇如半胱氨酸(Cys, 30～200 μmol/L)、高半胱氨酸(Hcy, 5～12 μmol/L)和谷胱甘肽(GSH, 1～10 mmol/L)，是广泛存在于细胞内的重要巯基小分子氨基酸，在维持生物体内的氧化还原稳态和蛋白质的生物学构象等方面发挥着重要的作用[1-2]。生物硫醇在细胞内的含量变化与生物体内的多种疾病息息相关，如Cys浓度异常易引起嗜睡、皮肤病、肝脏损伤、儿童生长缓慢和身体肥胖衰竭等疾病；血清Hcy浓度异常高易造成认知功能异常和心血管疾病等；GSH浓度与多种细胞功能相关如生长、代谢、对癌症的放化疗的耐药性等[3-5]。因此实现生物硫醇的特异性检测对于生物体内疾病的评估和诊断具有非常重要的意义。

与传统的生物硫醇的检测方法相比，荧光分析法因具有操作简单、损害性小、灵敏度和准确度高等优点因此收到了广泛关注[6-7]。近年来，国内外研究相继报道了一些选择性检测Cys的荧光探针。如基于激发态分子内质子转移(ESIPT)原理的分子，基于“酮式-烯醇式”互变异构现象，实现分子内的共轭结构发生极大的变化，光谱发生明显的红移，Stokes 位移值增大，有效消除荧光的自吸收现象，增强背景荧光和目标荧光的对比度，从而提高分子的灵敏度[8]。本研究设计合成了一种基于ESIPT原理的反应型Cys荧光探针(图1，探针1)。探针1以2-(2-呋喃基)-3-羟基色酮为基于ESIPT原理的生色团，丙烯酸酯为识别基团和淬灭基团。虽然探针1没有荧光，但在Cys存在下，淬灭基团脱落，实现水溶液条件下对Cys的选择性识别。此外，探针1还具有低毒性和良好的细胞膜通透性，能用于活细胞内外Cys的荧光成像研究。

1 实 验

1.1 主要试剂及仪器

2-羟基苯乙酮、丙烯酰氯、N-乙级马来酰亚胺，上海阿拉丁试剂有限公司。

1H NMR和13C NMR经Bruker DRX-600M 型核磁共振仪测得。紫外吸收光谱经Shimazu Co UV-2600型紫外-可见分光光度计测定。荧光光谱由Hitachi F-4600型荧光分光光度计测定。ESI-HRMS经Bruker micro TOF-Q II高分辨质谱仪测定。细胞荧光成像实验经Olympus IX73倒置荧光显微镜测得。

1.2 探针的合成与表征

依据文献[9]，合成了化合物1(2-(2-呋喃基)-3-羟基色酮)。将化合物1(0.226 g, 1 mmol)溶于二氯甲烷溶液(15 mL)中，冰盐浴条件下缓慢滴加三乙胺(0.5 mL)，滴加完毕后继续搅拌0.5 h，继续滴加丙烯酰氯(0.27 g, 3 mmol)的二氯甲烷溶液。TLC检测反应完全后，少量的水淬灭反应，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，柱层析(PE:CH2Cl2=3:1)分离得到白色针状晶体(0.16 g，56%)。m. p. 146.5～147.5 ℃。1H-NMR (600 MHz, CDCl3):d8.24 (d,J=7.9 Hz, 1H), 7.70 (t,J=7.7 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.56 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.41 (t,J=7.4 Hz, 1H), 7.15 (s, 1H), 6.71 (d,J=17.3 Hz, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.46 (dd,J=17.3, 10.6 Hz, 1H), 6.12 (d,J=10.5 Hz, 1H) ppm；13C-NMR (150 MHz, CDCl3):d171.87, 163.15, 155.33, 148.05, 146.31, 144.16,134.18, 134.06, 127.17, 126.34, 125.47, 123.95, 118.23, 116.44, 112.78 ppm；HEMS(ESI):m/z calculated for C16H10O5: 282.0528. Found:[M+Na+]: 305.0428。

图1 2-(2-呋喃基)色酮-3-丙烯酸酯(探针1)的合成路线

1.3 样品的配置与测试

准确称取一定量的探针1溶解于DMSO中，配置为3 mmol/L的母液；各种氨基酸溶于超纯水中配置为1 mmol/L的母液，使用时用乙腈-磷酸盐缓冲溶液(CH3CN:PBS,3:7,V:V, pH 7.4)稀释至所需浓度。于室温条件下测定了探针1与不同浓度氨基酸的紫外吸收光谱和荧光发射光谱，Ex=360 nm，激发和发射的狭缝均为5 nm。

1.4 荧光成像

将A549细胞(1×104)接种于6孔板中，于37 ℃(5%CO2)培养箱中培养24 h后[10]，换取新的培养基，分别进行如下实验：(1)空白组；(2)实验组：加探针1(20 μmol/L)共孵育30 min；(3)抑制剂组：先加N-乙级马来酰亚胺(NEM，1.0 mmol/L)[11]共孵育30 min后，然后加入探针1(20 μmol/L)继续孵育30 min；(4)对照组：先加入巯基抑制剂N-乙级马来酰亚胺(NEM，1.0 mmol/L)共孵育30 min后，再加入Cys(200 μmol/L)继续孵育30 min，最后加入探针1(20 μmol/L)孵育30 min。实验后细胞应用PBS洗涤2～3次，荧光倒置显微镜观察并拍摄细胞成像。

2 结果与讨论

2.1 识别性能研究

为了证明探针1具有选择性识别Cys的能力，首先测试了探针1与Cys反应前后的紫外光谱和荧光光谱。由图2A可知，探针1紫外光谱图的特征吸收峰位于330 nm处；但加入Cys后，最大吸收峰快速红移至360 nm，等吸光点位于346 nm。以上数据表明，随着Cys的加入溶液中有新的物质产生，也证明Cys具有快速识别淬灭基团的能力。于360 nm光激发下，探针1在520 nm处的荧光较弱；但加入Cys后，520 nm处的荧光信号峰迅速增强且于化合物1的荧光光谱信号峰几乎重叠，且在365 nm紫外灯照射下，呈现明显的亮绿色荧光。此外，具有相似结构的巯基氨基酸(Hcy或GSH)不能引起520 nm处的荧光信号峰的快速增强，以上数据证明探针1还具有选择性识别Cys的能力。

图2 探针1与Cys反应前后的紫外光谱(A)和荧光光谱(B)

图3 反应时间(A)和pH(B)对探针1与Cys反应前后荧光光谱的影响

基于此，为了进一步确定反应时间和反应溶液的pH值对探针1快速识别Cys能力的影响，测试了探针1与Cys(10倍)随不同反应时间和pH值条件下的荧光光谱。随着反应时间的变化，不同的巯基氨基酸与探针1的响应不同。由图3可知，探针1具有良好的光稳定性且不受溶液pH值变化的影响；Hcy和GSH的加入，引起520 nm处荧光信号峰的变化较弱；只有Cys能够引起520 nm处的荧光信号峰迅速增强且随溶液pH值的增大而迅速增强，且于15 min、pH=7.4 时达到最大值。荧光光谱信号变化说明探针1具有良好的光稳定性，且与Cys反应前后呈现良好的“off-on”过程，故15 min作为探针1与氨基酸的室温反应时间；为了方便后续荧光成像实验研究，选择反应体系的pH值为7.4。

2.2 灵敏度

为了进一步探究探针1的灵敏度，测试了探针1(20 μmol/L)与不同当量的Cys(0-200 μmol/L)在CH3CN:PBS(3:7,V:V, pH 7.4)中的反应荧光光谱。由图4A可知，探针1于520 nm处的荧光信号强度与Cys浓度呈现良好的量效关系，在10～100 μmol/L范围内浓度与荧光强度呈现良好的线性关系(y=4.127x+42.84,R2=0.9978)(图4B)。依据检测限的标准计算公式(LOD=3s/k)，求得探针1对Cys的最低检测限为36.7 nmol/L，远远低于生物体内Cys的含量(30～200 μmol/L)。上述实验结果表明探针1对Cys的荧光检测选择性显著，线性关系良好，检测线更低，可用于定量分析检测生物体内Cys。

图4 探针1与不同浓度Cys作用的荧光光谱图(A)及线性关系图(B)

2.3 抗干扰能力

为了证明探针1对Cys的特异性识别，测试了探针1与各种常见氨基酸的荧光响应情况。如图5所示，可以发现探针1对其它氨基酸的响应作用相对较弱；而对Cys的响应于520 nm处能够产生明显的荧光信号增强。在选择性实验的基础上，进一步考察了其它共存氨基酸对探针1选择性识别Cys的影响。结果表明其它氨基酸几乎不会干扰探针1对Cys的选择性识别，520 nm处荧光信号强度与对照组近似。可以判定探针1对Cys具有良好的选择性和抗干扰能力，可用于选择性识别Cys。

图5 探针1与不同氨基酸作用前后的荧光强度矩形图

2.4 检测机理

为了确定探针1与Cys的识别机理，测试了探针1与Cys反应前后的1H NMR。在探针1与Cys作用前，丙烯酸酯双键中的3个氢1H NMR位于6.2～6.8 ppm；而加入Cys作用20 min后，这3个氢信号峰消失，同时在4.3 ppm处新出现1个氢信号峰，归属为己内酰胺中氢的特征信号峰，表明探针1与Cys发生了亲核加成-环化脱保护反应，裂解出内酰亚胺，同时释放出荧光母核；基于ESIPT机制，促使母核荧光信号增强。为了进一步解释此反应机理，借助HRMS-ESI分析技术探索了探针1与Cys的反应前后化合物的分子离子峰。探针1的分子离子峰为m/z 305.0248，反应15 min后的分子离子峰分别位于m/z=229.0502和 122.0270，分别对应母核化合物1和过量的Cys。故推测其反应机理如见图6所示：首先Cys的巯基与探针1的丙烯酰基的双键发生Michael加成反应，随后反应中的Cys氨基进攻酯基发生分子内的环化反应，同时释放荧光母核化合物1和较稳定七元环化合物己内酰胺，这与文献报道类似结构荧光探针识的别机理相一致[12]。

图6 探针1检测Cys的机理示意图

2.5 荧光成像实验

鉴于探针1对体外Cys具有良好的选择性识别性能，继续探究探针1对生物体内的Cys是否具有识别性能。首先借助MTT分析了探针1与细胞共同培养24 h后的细胞毒活性。结果证明探针1浓度高达50 μmol/L培养24 h后，80%以上的细胞存活状态良好，证明探针1细胞毒性较低。接着进一步评价探针1对细胞内Cys识别性能。如图7所示，当探针1(20 μmol/L)与A549细胞共孵育30 min后，细胞呈现出亮绿色荧光(图7 B)；当选用生物巯基抑制剂NEM与A549细胞共孵育30 min后，再加入探针1，细胞荧光信号显著淬灭(图7C)；在上述实验的基础上，调整试验顺序，先加入生物巯基抑制剂与A549细胞共孵育30 min后，再加入Cys(200 μmol/L)继续孵育30 min，最后加入探针1，细胞继续发出亮绿色荧光(图7D)。上述实验结果证明探针1具有良好的细胞膜通透性且细胞毒性较低，可用于生物体内/外Cys的选择性检测，也为生物体Cys的选择性检测提供一种可行的分析方法。

图7 细胞荧光成像

3 结 论

本研究基于ESIPT原理制备了一种反应型半胱氨酸荧光探针1，该探针与Cys作用后，展现出明显的荧光“关-开”变化。光谱实验结果表明，探针1对Cys具有Stokes位移大(160 nm)、选择性和灵敏度高、检出限低(36.7 nmol/L)等特征。更重要的是，探针1具有低毒、良好的细胞膜通透性，可用于细胞内外Cys的荧光成像研究。故本研究为深入研究机体内Cys的生理及病理功能，提供一种潜在的分析方法。