补阳还五汤调节血管内皮细胞炎症信号通路干预高血压前期血管损伤机制

薛亚楠， 张立德， 王建波， 孙杰， 曲怡*

(1.辽宁中医药大学中医药创新工程技术中心， 沈阳 110000； 2.中医脏象理论及应用教育部重点实验室， 沈阳 110000)

高血压作为常见慢性病，是引发心肌梗死、脑出血等心脑血管疾病的最重要危险因素[1]。预计到2025年，全球高血压患者将达到15亿以上[2-3]，因其导致的痴呆患者在2030年将达到7 550万人[4]。若不对高血压进行早期干预，其患病率将持续增加，与血压相关的心血管疾病也将造成全球范围内较大的经济负担[5]。大量研究表明，高血压与内皮功能障碍有关，内皮功能障碍是一种在宏观和微循环水平上检测到的改变[6-8]。内皮在维持血管内环境稳定方面起着至关重要的作用，而内皮功能障碍可使全身血管阻力增加而引起高血压的发生[9-11]。因此，内皮功能障碍被认为是高血压病理生理学中的早期事件，是亚临床靶器官损伤的催化剂[12]。内皮损伤的修复和内皮功能的改善对血压调节和相应的靶器官保护皆具有重要意义，可能是高血压患者抗高血压药物治疗的一个重要靶点。

人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的生物学特征同血管内皮细胞高度相似，接近人体生理状态，无种属差异且符合伦理性[13]。补阳还五汤作为益气活血法的代表方剂被广泛应用于临床治疗心脑血管疾病，研究证实补阳还五汤不仅能通过纠正高血压病气虚血瘀症的相关基因以及miRNA表达的失衡抑制细胞凋亡[14]，还能通过抑制高血压脑出血恢复期患者的神经凋亡而改善血液循环提高疗效[15]。研究发现，补阳还五汤能有效干预血管内皮功能损伤并加强对内皮功能障碍的逆转性治疗，进而起到良好的保护血管作用。在高血压病气虚血瘀证模型的治疗中，补阳还五汤通过减少血管内皮细胞损伤标志物的表达起到了保护血管的作用[16]。因此，现从高血压前期入手，以体外培养的人脐静脉内皮细胞为观察对象，以细胞检测技术为媒介，观察补阳还五汤对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎症信号通路的反应，探讨其防治高血压前期血管损伤的作用机制，对临床高血压病的治疗和提高人民生活质量具有重大的意义。

1 材料与方法

1.1 细胞株

选用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，购于吉妮欧生物科技有限公司。

1.2 药物与制备方法

TNF-α配制：将TNF-α粉末(购自南京金斯瑞生物科技有限公司)充分溶解于PBS溶液中，配制成1 μg/mL的母液后于-20 ℃保存，使用时用空白培养基稀释成工作浓度。

补阳还五汤：黄芪30 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，当归6 g，地龙3 g，桃仁3 g，红花3 g，共52.5 g，购自辽宁省中医院中药局。用52.5 mL高压灭菌水溶化药物，完全溶化后将中药溶液旋转蒸发浓缩。反应条件：200 r/min，50 ℃，使用真空冷凝干燥机对浓缩后的药物进行冻干处理48 h，制成冻干粉。使用超纯水溶解冻干粉制备中药母液，并用0.22 μm滤器过滤除菌，置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.3 实验试剂及仪器

胎牛血清(Gibco公司)；RPMI 1640培养基(江苏凯基生物技术股份有限公司)；青链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司，批号：P1400)；胰蛋白酶-EDTA消化液(江苏凯基生物技术股份有限公司，KGY0012)；Trizol(碧云天生物技术，批号：P1275601)；引物设计合成(北京博迈德基因技术有限公司)；HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(CW2582M)；Hoechst 33342(Solarbio)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术，Cat No. P0011)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；NF-κB p65 单克隆抗体(Cat No.66535-1-Ig)、IκB 多克隆抗体(Cat No. 15649-1-AP)。

CO2恒温培养箱(Thermos scientific)；超净工作台(ESCO)；细胞计数仪(LUAII)；高内涵细胞成像和分析系统(Operetta CLS)；荧光定量 PCR仪(Applied Biosysterms 7500)；梯度 PCR 扩增仪(Applied Biosystems)；多功能酶标仪(SpectraMax I3奥地利Molecular Devices公司)。

1.4 细胞培养、分组及造模

HUVECs用含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基(加入100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)培养，培养条件：37 ℃、5% CO2、饱和湿度。每48 h更换1次培养基，3 d传代一次，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化3 min，接种于25 cm2培养瓶，置于6孔板或96孔板中，根据细胞生长状况收集对数期生长的细胞进行后续实验研究。

将传代后的细胞分为5组：空白组、模型组、补阳还五汤低剂量组、中剂量组和高剂量组。待细胞融合至80%左右时，除正常组外，其余4组给予 10 ng/mL TNF-α造模处理，24 h后抽离造模液，空白组和模型组予以10%空白血清培养基，中药干预组分别予以0.5%、1%、2%补阳还五汤干预处理，各组继续培养24 h后弃上清液，进行后续不同实验检测。

1.5 指标检测

1.5.1 高内涵观测细胞数量

收集对数期生长细胞并将其接种至高内涵专用96孔板内，分组造模24 h后加入Hoechst 33342工作液对HUVECs核进行染色，每孔加入100 μL充分覆盖待染色细胞。在培养箱内培养20 min后弃染色液，PBS洗涤3次后加入含不同浓度的补阳还五汤培养液，放入高内涵仪器内继续培养24 h，在高内涵自动分析系统中进行细胞数量检测并拍照。

1.5.2 荧光定量PCR法检测各组HUVECs内NF-κB信号通路中相关炎症因子的mRNA的表达

将对数期生长的细胞接种于6孔板，经TNF-α造模及补阳还五汤干预处理后，每孔加入1 mL Trizol裂解液，采用萃取法提取总mRNA，测量RNA浓度后反转录为cDNA，荧光定量PCR仪进行扩增，反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，59 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；扩增引物见表1。

1.5.3 Western blot法检测各组HUVECs内NF-κB p65和IκB的蛋白表达

将对数期生长的细胞接种于25 cm2培养瓶内，经TNF-α造模及补阳还五汤干预处理后，使用 RIPA 裂解液收集细胞，BCA蛋白定量测定试剂盒进行定量。60 μg蛋白上样后使用SDS-PAGE电泳及电转移PVDF膜，37 ℃条件下5%脱脂乳粉封闭1 h，一抗4 ℃过夜，TBST洗涤5次(5 min/次)，HRP标记的二抗37 ℃孵育1 h后用TBST洗涤5次后使用ECL检测试剂盒进行曝光。GAPDH作为内参对蛋白条带进行对比分析。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 补阳还五汤对HUVECs生长增殖的影响

图1所示的实验结果表明，10 ng/mL TNF-α造模处理24 h后明显抑制了内皮细胞的生长增殖。补阳还五汤通过抑制TNF-α诱导的HUVECs损伤促进了细胞增殖，且补阳还五汤中剂量组效果最为明显。

2.2 补阳还五汤对各组HUVECs内NF-κB信号通路相关炎症因子mRNA表达的影响

实验结果显示，与空白组相比，模型组NF-κB、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1 mRNA表达明显增加，IκB mRNA表达明显减少(P<0.05)；与模型组比较，补阳还五汤能明显抑制NF-κB、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1 mRNA的表达，促进IκB mRNA的表达，且中剂量组效果显著，结果见表2和图2。

2.3 补阳还五汤对各组HUVECs内NF-κB p65和IκB蛋白表达的影响

结果显示，与空白组相比，模型组NF-κB p65蛋白表达明显增加，IκB蛋白表达明显减少；与模型组相比，中药干预中剂量组NF-κB p65蛋白表达显著减少，IκB蛋白表达显著增加，低剂量组和高剂量组不明显，结果见表3和图3。

表2 各组HUVECs内ICAM-1、VCAM-1、MCP-1 mRNA表达

表1 扩增使用引物

图1 补阳还五汤对HUVECs生长增殖的影响Fig.1 Effect of Buyang Huanwu Decoction on the growth and proliferation of HUVECs

与空白组比较，▲代表P<0.05；与模型组比较，●代表P<0.05图2 各组HUVECs内NF-κB和IκB mRNA表达Fig.2 mRNA expression of NF-κB and IκB in HUVECs of each group

表3 补阳还五汤对HUVECs内NF-κB p65和IκB 蛋白灰度值影响

图3 各组HUVECs内NF-κB p65和IκB蛋白表达变化Fig.3 Protein expression of NF-κB p65 and IκB in HUVECs of each group

3 讨论

内皮功能障碍是高血压发生发展过程中血管变化的一个核心组成部分，其特征是内皮促炎症和促血栓反应伴随血管舒张功能障碍[8,17-18]。高血压通过各种因素引起血管损伤，压力水平和血管变化之间是一个周期性和逐渐演化的过程，在这个过程中，因心血管系统紊乱随着压力的升高而增加了神经体液活动，反过来导致血管结构和功能的变化，提高了血管阻力，从而使血压升高[5]。血管内皮功能障碍始发于高血压前期和(或)中早期，临床症状虽不显著，但基于中医“治未病”理论，此阶段的中医治疗是干预临床高血压的一个重要环节。TNF-α主要是由巨噬细胞产生的炎症细胞因子，参与了多种代谢性疾病引起的血管内皮细胞功能障碍和血管损害[19-20]。既往研究显示[21]，在体外培养的 HUVECs 中，TNF-α通过抑制eNOS转录能增加氧自由基的表达，证实了炎症细胞因子TNF-α与高血压引起的血管内皮细胞功能障碍和心血管的损害有密切关系[22]。综合已有研究和课题组前期实验证实，HUVECs高血压前期损伤模型以TNF-α为造模剂时，造模剂浓度为10 ng/mL，造模时间为24 h时，成功建立HUVECs高血压前期血管损伤模型。

NF-κB是几乎存在于所有细胞类型中参与炎症反应、应激反应、免疫和凋亡等生理病理过程中的调节因子，通常以NF-κB p65/p50二聚体的形式存在于细胞质中[23-26]。NF-κB 信号传导通过驱动炎症细胞因子和趋化因子的产生来建立低浓度的炎症环境，导致免疫细胞的募集而增强炎症反应。当细胞受到TNF-α刺激时，刺激因子与细胞表面TNF-α受体结合将细胞内的TRAF-6(TNF receptor-associated factor 6)等衔接蛋白募集至细胞膜附近；磷酸化的TRAF-6使IKKβ磷酸化并将其激活，引起下游底物IκBα的磷酸化；细胞内泛素系统的复合物识别被磷酸化修饰的IκBα使之泛素化并被细胞内的蛋白酶体识别并降解，IκB的降解使NF-κB二聚体核易位并发生解离，胞质进入胞核内并与靶基因上的特异性位点结合从而启动炎性细胞转录和表达，产生大量的炎性介质，最终诱发炎症反应[27-29]。与此同时，NF-κB通过与多种基因启动子特异性序列结合而上调了包括单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞间黏附分子-1(VCAM-1)的转录活性。ICAM-1和VCAM-1是均能介导血管内皮细胞与白细胞黏附的免疫球蛋白超家族成员[30]；MCP-1既是趋化类细胞因子，也是重要的促炎细胞因子，在单核细胞和内皮细胞等不同细胞中均有表达。MCP-1在内皮细胞受损时高表达，通过将单核细胞转化为巨噬细胞，然后在血管内皮下摄入脂质形成泡沫细胞启动动脉粥样硬化，是内皮细胞损伤的早期标志物之一[31-32]。当血管内皮细胞损伤时，炎症刺激细胞表面而引发内皮细胞发生黏附性改变，内皮细胞被激活并大量分泌ICAM-1、VCAM-1等细胞因子，细胞因子通过与配体的相互作用而介导白细胞与血管内皮细胞发生的黏附性改变，通过刺激内皮细胞收缩等一系列活动引发内皮细胞的损伤和功能障碍[33-35]。

4 结论

模型组NF-κB p65蛋白表达明显增高，IκB mRNA和蛋白表达均明显下降，NF-κB、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1 mRNA表达显著增多，表明TNF-α造模高血压前期HUVECs炎症损伤成功。经中药治疗后，补阳还五汤中剂量组可以显著下调NF-κB p65蛋白和NF-κB、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的 mRNA表达，上调IκB的蛋白与mRNA表达。表明补阳还五汤通过抑制NF-κB信号通路的激活而缓解了HUVECs的炎症反应，进而发挥了保护血管的作用。实验结果说明高血压前期的血管损伤与血管炎症反应NF-κB信号通路有关，补阳还五汤中剂量组能纠正该信号通路相关基因表达的失衡，具有抑制高血压前期内皮细胞损伤的作用。但是，关于高血压前期血管损伤的研究还不够深入。课题组拟计划下一步从动物水平和细胞水平同时进行研究，对临床高血压的防治起到警示作用。